植物分子生物学实验技术

精选文库植物分子生物学实验技术班 级：研122班专 业：作物生物技术姓 名：陕建国学 号：20122419授课教师：李红英老师实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论一、提取植物DNA和RNA的用处提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。（一）提取植物DNA的用处DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法提取植物DNA的试验原理：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。（一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验试剂：1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2、10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4、0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6 氯仿异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1molL HCl。10、0.2mol/L NaOH。11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液浓乙醛：H2O1：50（VV）。12. 1.0mol/L 高酸溶液（HClO4）。13、高氯酸溶液。14、0.05mol/L NaOH。15、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/L NaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml 1mol/L HClO4，混合冷却后用0.5mol/L HClO4定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。实验步骤 ：1、 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2、 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3、 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4、 将试管置72水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L 高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1（VV），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5、 再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6、 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7、 然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8、 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9、 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5070g/ml，并在37水浴中保温30min，以除去RNA。10、 加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11、 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。（二）植物DNA的CTAB提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验步骤：1、 称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。2、 将粉末转移到加有7ml经预热的15CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65水浴中，温育30min。3、 取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。4、 将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。5、 转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。6、 加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5l RNase置于56水浴中过夜。7、 待DNA完全溶解后，加2-3ml 4预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。8、 离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。9、 将风干的DNA直接在4保存备用或溶于100l TE溶液中于-20保存. （三）植物叶片的提取步骤（来自/Invite/23b2c5d6b04a43e2bbfcd1e1a002dc21）实验步骤1、在50ml带盖离心管（放在-20度预冷）中加入20ml提取缓冲液I，60水浴预热。2、水稻幼苗或叶子510g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温3060分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静止510分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。4、室温下5000rpm离心5分钟。5、仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6、在1.5ml eppendorf 管中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。7、如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。9、加入5lRNaseA（10g/l）,37 10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10、加入1/10体积的3mol/L NaAc 及2体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。11、用玻璃捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。12、将DNA重新溶解于1 ml TE中，20贮存。三、植物RNA的提取植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占15。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3末端都具有20200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。 植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。 内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。 外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.050.1DEPC，37处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22m 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。 提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3 H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。 尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。 影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化；或用巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。（一）小麦叶片及不同时期种子的RNA的提取（赵双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法 山东大学生命科学学院,济南）1、取510g材料放入研钵中，加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（在研磨过程中，保证材料始终浸在液氮中，研磨约30min左右）。2、待液氮自然挥发干净后，将材料转入100ml的离心管中，加入68倍体积的裂解缓冲液，轻轻搅拌后，0冰浴20min。3、12000r/min，4离心15min。4、取上清液，加1/3体积的3mol/L醋酸钠（pH 5.3），1/5体积的氯仿-异戊醇（24:1)，轻轻混匀，0冰浴20min（加5倍体积裂解缓冲液溶解沉淀以提取DNA)。5、12000r/min，4离心15min。6、取上清，加入等体积冰浴冷却的异丙醇，混匀且冰浴10min。7、5000r/min，4离心10min。将沉淀溶于5ml含有0.1%的SDS缓冲液中，加入8mil/L LiCl使终浓度至2.5mol/L，冰浴4过夜。8、12000r/min，4离心10min。9、70%乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥10min后，溶于DE-PC处理的TE或水中。加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。-70冰箱保存。裂解缓冲液成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+0.1%LDS。裂解缓冲液成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+1%LDS。（二）植物总RNA的提取（百度文库）Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol试剂配制苯酚饱和液（38%）-380ml/l 、硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 、硫氰酸铵（0.4M）- 76.12g 、醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 、甘油 50ml ，加水至1L实验试剂1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、氯仿:异戊醇 24 : 1 （v/v) 、氯仿。4、异丙醇、无水乙醇、70乙醇。5、Trizol试剂。操作步骤1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品；.每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置分钟、 10000r/min离心10分钟、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4下r/min离心5分钟。、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70（三）CTAB方法提取植物叶片RNA（百度文库）操作步骤1、取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。 2、每管加入10ml65预热的CTAB提取液和500l -巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65水浴温育30min。 3、每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4，12000rpm离心10min。 4、取上清，加入13体积的8M LiCl和500l -巯基乙醇，-20沉淀过夜。 5、4，12000rpm离心20min。 6、弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120l -巯基乙醇和880l 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 7、取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 8、取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 9、取上清，加入110体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20放置过夜。 10、4，14000rpm离心20min。弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，每次洗涤后，14000rpm离心10min，弃上清。冰上干燥RNA沉淀。 11、加入100l RNase-free-ddH2O溶解沉淀。取10l稀释200倍检测UV 230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。取5g进行RNA样品的电泳检测，以检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于70下保存。（四）硅藻土 - 苯酚法（一种广泛适用的 RNA 提取方法）（来自李晓宇的方法）利用硅藻土能够有效吸附 RNA 酶的特性，结合高盐、PVP 及乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量 RNA 提取方法. 该方法适应性广，可以从富含 RNase 及多糖、多酚等代谢产物提取 RNA 困难的动、植物及微生物材料中提取高质量总 RNA植物组织RNA提取的难点及对策。具体步骤：（全过程均在冰上操作，保持样品温度在 04）1、样品液氮速冻，于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管；2、按照4 ml/g 的比例加入硅藻土提取缓冲液，充分震荡后加入 1/2 体积的水饱和酚和 1/2 体积的氯仿异戊醇(241)，震荡混匀；3、412 000g离心 10 min，取上清加入等体积 5 mol/L KAc(pH 4.8)，混匀后冰浴10 min；4、413 000g 离心 10 min，液相转入新管，重复上述酚仿抽提，直至界面清亮；5、上清移入新管，加入等体积乙二醇丁醚，混合均匀后，冰上放置 1 h；6、414 000 g 离心 15 min，沉淀用 75%乙醇洗 2 次，空气干燥后用适量 DEPC-H2O 溶解，- 70保存。硅藻土提取缓冲液：20 mmol/L 柠檬酸钠(pH 7.0)， 10 mmol/L EDTA， 0.5% SDS，1% - 巯基乙醇，100 mmol/L NaCl，1.9 g/L 处理过的硅藻土。(121高压灭菌 20 min，冷却后再加入 1% - 巯基乙醇，4保存) 。硅 藻 土 的 处 理 ： 5g硅藻土用 50 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)溶解，于 100放置5 min。室温2500g离心5min。弃上清，沉淀用40 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。重复离心和重悬的步骤两次。 超声 1 min。室温3500g离心15min.。沉淀用30ml 50mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。4储存。实验二：PCR 及QPCR普通的PCR是进行定性分析的，而QPCR是进行定量分析的，是检测初始量的，并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。一、PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。（一）PCR的原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。（二）PCR反应体系（百度文库）10扩增缓冲液10l4种dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100 l1、无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。2、Mg2 :终浓度为1.52.0mmol/L，其对应dNTP为200 mol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。其浓度越小，酶的特异性就越高。3、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。4、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。5、Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7580，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。6、模板：不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。7、引物：引物浓度一般为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 (三)PCR引物设计（百度百科）PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。 引物设计的基本原则： 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 （四）PCR的步骤（百度文库）PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：第一步、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；第二步、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第三步、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。（八）PCR的种类（百度文库）种类原理备注反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA后酶切片段自身环化以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段 。该方法的不足是：需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。不对称PCR(asymmetric PCR)技术两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用501001比例。在最初的1015个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 。巢式PCR(NEST PCR)技术先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。主要用于极少量DNA模板的扩增。等位基因特异性PCR技术ASPCR依赖于引物3- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象, 相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技术LSSP - PCR 是建立在PCR 基础上的又一种新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”, 高浓度的单链引物( 5- 端/ 3- 端引物均可),约4. 8Lmol,高浓度的Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) , 低退火温度( 30),所用的模板必须是纯化的DNA片段。在这种低严格条件下, 引物与模板间发生不同程度的错配, 形成多种大小不同的扩增产物, 经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的基因而言, 所形成的带型是固定的, 因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。复合PCR(multiplex PCR)技术在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。重组PCR技术重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。二、QPCRQPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。其就是利用荧光信号的变化实施检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。（一）QPCR的原理（来自You are so late的新浪空间）实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。（二）Real-time qPCR的种类荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这2种方法，其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。第一种：非特异性SYBR Green I染料法SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（结合示意图），在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。第二种：特异性Taqman水解探针法Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。（三）Real-time qPCR实验设计1. 引物设计一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80-150bp引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性产物不能形成二级结构产物长度一般在15-30碱基之间G+C含量在40%-60%之间碱基要随机分布引物自身不能有连续4个碱基的互补引物之间不能有连续4个碱基的互补引物5端可以修饰引物3端不可修饰引物3端要避开密码子的第3位2. Real-time qPCR操作过程（百度文库）（1） RNA提取和反转录RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：a.全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。b.使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。c.在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。（2）Mix配制一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。（3）仪器设置 按照说明书对仪器进行设置，设置之后就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！实验三：分子克隆技术分子克隆又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术，是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体内）方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。一、分子克隆技术的基本工具（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”(百度文库)切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。1、限制性内切酶的种类根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的；第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量；第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。 其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。因此以下内容均以II 类限制性内切酶为主。2、限制性内切酶的特点（1）识别特定的核苷酸序列：长度一般为46bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从53方向所读的顺序完全一样）；（2）具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5突出的粘末端；3突出的粘末端；平末端；（3）由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。（二）DNA连接酶“分子缝合针”能够将两条DNA链连接起来的酶，称之为DNA连接酶。 已发现的DNA连接酶主要有两种：（1）Ecoli DNA连接酶：它是从大肠杆菌中分离得到的，它只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接；（2）T4 DNA连接酶：它是从T4噬菌体中分离出来的。它对黏性末端和平末端都可以进行“缝合”，但连接平末端的效率比较低。（三）基因进入受体细胞的载体“分子运输车”（百度百科）一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors。最主要的载体是质粒、噬菌体和病毒，分别应用于原核细胞或真核细胞。从功能来分，有克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。1、 载体一般要求（1）能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。（2）容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。（3）容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。（4）容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。（5）有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。2、载体的类型在基因工程中通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞中。此外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等作为载体。质粒载体的特点：是染色质外的双链共价闭合环形DNA；能自主复制，是能独立复制的复制子；质粒对宿主生存并不是必需的。3、常用的载体二、分子克隆技术的基本操作步骤（来自陈宏主编的基因工程原理与应用）（一）目的基因的获取（分、切）目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成，具体的方法有：1、从基因文库中获取目的基因：根据目的基因的有关信息（如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性）来获取目的基因，这是一项比较复杂的工作。2、利用PCR技术扩增目的基因： PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，以此可以获取大量的目的基因。3、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。（二）基因表达载体的构建（接）构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接