信号强度决定STING的促凋亡功能

Signalling strength determines proapoptotic functions of STING,Muhammet F. Gulen1, Ute Koch2, Simone M. Haag1, Fabian Schuler3 Lionel Apetoh 4, Andreas Villunger3,5,Freddy Radtke2 & Andrea Ablasser,2017.11.7Nature chasing people,Nature communication,Background,Mammalian cells use cytosolic nucleic acid receptors to detect pathogens and other stress signals. In innate immune cells the presence of cytosolic DNA is sensed by the cGASSTING signalling pathway, which initiates a gene expression programme linked to cellular activation and cytokine production. Whether the outcome of the STING response varies between distinct cell types remains largely unknown. 科学问题：在不同的固有免疫细胞，STING应答产生的结局一样吗？,脾脏T细胞纯化采用：荧光激活细胞分选术；CMA：丫啶酮乙酸，STING激动剂,a.0.25mg/ml CMA分别作用30-60-90min，wt小鼠CD4+T的STING、p-TBK1、p-p65均有表达，STING-/-小鼠无STING、p-TBK1；b. 予0.25mg/ml CMA刺激4h， wt小鼠CD4+T的ifnb1、ifnb2的mRNA表达增加，但倍数不很明显（a+b说明模型构建成功）；c. CD4+T和DC分别予0.25mg/ml CMA刺激16h，用bioassay试剂盒测上清IFN蛋白，CD4+T组几乎测不到，而DC组则显著增多；d. CMA刺激16h，随浓度增加wt脾CD4+T细胞活力下降（用cellTiter blue试剂盒），但STING-/-的CD4+T活力几乎无改变；e. AnnexinV染色测凋亡，wt的CD4+T凋亡率60%，而STING-/-CD4+T几乎无凋亡；f. 抗-CD3+抗CD28扩增的wt脾CD4+T，0.25mg/ml CMA作用15min-4h，Cl-caspase3在1h开始表达，表明WTCD4+T的STING活化1h后开始激活凋亡蛋白。,Figure1,STING应答引起T细胞凋亡,STING在T辅助细胞亚群中应答，引起各亚群细胞死亡,a. Wt分选出 CD4+T Naive细胞，加Th0、Th1、Th2、Th17分化条件，培养3天后，饥饿过夜，加0.25mg/ml CMA 1h，收蛋白wb检测，Th1、Th2、Th17三亚群加CMA后STING和p-TBK1均表达；b. WT来源的CD4+和CD8+T接受0.25mg/ml刺激过夜后，细胞活力均50%；c. Wt分选出 CD4+T Naive细胞，加Th0、Th1、Th2、Th17分化条件，培养3天后，加0.25mg/ml CMA培养过夜，细胞活力均显著下降。 SF2.wt和STING-/-来源的T细胞，加0.25mg/ml CMA刺激6h后，用caspase-Glo 3/7 Assay试剂盒，结果wt的 T细胞caspase3/7活性显著增加，提示凋亡增加,STING活化特异性诱导T细胞凋亡,a.WT原代小鼠胚肺细胞MEF、DC、M细胞,加0.25mg/ml CMA 16h测细胞活力，STING激活不引起MEFDC、M 凋亡，同时收蛋白wb，发现三种细胞STING表达程度没有CD4+T高；b.在wt和STING-/-来源的CD4+T中分别加0.125mg/ml、0.25mg/ml过夜，随CMA浓度增加，细胞活力显著下降；DMXAA（另一种STING激动剂）为10g/ml、100g/ml，DMXAA呈浓度依赖性降低细胞活力；十字胞碱、依托泊苷、阿霉素都是DNA损伤药物，三种药物均呈浓度依赖性降低wt和STING-/-来源的CD4+T细胞活力，说明CMA和DMXAA二种STING激活剂特异性降低wt的CD4+T细胞活力，对其他DC、M固有免疫细胞活力无影响,Figure 2,Figure 3,BH-3结构域蛋白涉及STING介导的T细胞凋亡,a. Wt的CD4+T予0.25mg/ml CMA分别刺激6h和12h，AnnexinV/7-ADD双染，随CMA作用时间延长，CD4+T 细胞凋亡显著增加；b. RNA-seq表明BH3-结构域促凋亡基因高表达；Noxa和Puma被刺激4h后即显著表达上调，是测凋亡较好的标志物。c. wt和STING-/-来源CD4+T被0.25mg/ml CMA刺激4h和16h，wt组CD4+TBH3-结构域基因Puma、Bim、Bad在16h显著上调。d.wt和BCL-2转基因小鼠（促凋亡基因功能抑制）的CD4+T，加0.25mg/mlCMA刺激16h，AnnexinV/7-ADD检测表明bcl-2-TG组CD4+T细胞凋亡显著少于wt 证明：BH3-结构域蛋白涉及STING介导的T细胞凋亡,Figure 4,IRF3和p53调控促凋亡程序,A-c.对应基因敲除的小鼠来源的CD4+T，加0.25mg/ml CMA刺激16h后，AnnexinV/7-ADD测凋亡，同时RT-qPCR测BH3-结构域凋亡基因表达，结果TBK1和IRF3 KO小鼠CD4+T被CMA刺激后不能上调Ifnb1和Noxa表达，尽管TBK1 KO其Puma表达有下调，但在IRF3 KO却不明显；凋亡结果表明，TBK1 KO确实显著降低凋亡率，但IRF3 KO却不明显（虽IRF3在STING介导的T细胞活化中处于核心地位，但不足以概括所有转录应答）；p53是调控Puma的重要因子，p53 KO后，CMA刺激不能改变Ifnb1、Noxa表达（与wt比），它抵消Puma的表达增加，和IRF3 KO一样，p53 KO也能部分降低细胞凋亡；d.wb表明，CMA刺激CD4+T 30Min后DNA损伤指标p-H2A.X表达增加，而MDM2降解，同时p53表达增加,在DC或M 中STING信号依赖于TBK1活化的IRF3和NF-B p65，该主题为验证T细胞是否也依赖于该信号，用IRF3和TBK1敲除小鼠,该主题表明：IRF3和p53通过上调Noxa和Puma表达，共同调控STING介导的T细胞凋亡,科学问题：IFN-I通常能具有抗增殖功效，figure4主题所致的凋亡，也可能是IFN-I本身增强CMA效果，触发T细胞凋亡,Wt的CD4+T加0.25mg/ml CMAIFN-I受体拮抗剂，以及直接加IFN-，结果表明，不管IFN-I受体拮抗剂还是直接加IFN-，均不明显增加促凋亡基因表达以及影响细胞活力 证明：IFN-I对STING介导的T细胞死亡并不重要,BX795是TBK1抑制剂,Figure 5,STING强烈应答是诱导细胞凋亡的原因,科学问题：DC和M与T细胞一样具有完整的STING信号通路，为什么STING激活不能诱导促凋亡基因表达呢？见下页 我们假设：信号强度和持续时间在不同的固有免疫细胞，可能是不一样的,a.Wt来源的CD4+T和骨髓来源的M，予0.25mg/ml CMA刺激15min-4h，结果CD4+T的STING表达强度显著高于M，P-TBK1都在刺激1h后表达增加，2h开始降解，提示信号持续时间相同；b.CMA分别刺激2h和4h，M表达Ifnb1显著高于T细胞，但CMA不能诱导M表达Noxa和Puma，而CD4+T中2h促凋亡基因表达达峰；c. CMA(31.25-250g/ml)刺激过夜，结果随CMA浓度增加，M 表达Ifnb1增加，但表达Noxa、Puma不变，而CD4+T呈浓度依赖性高表达凋亡基因；d.用不同浓度多西环素诱导M 表达STING增加，再予逐渐高浓度的 CMA刺激过夜，e.随CMA浓度增高，M 细胞活力显著下降，f.M中存在多西环素诱导STING表达增强后再予CMA时，M显著高表达Noxa和Puma。 证明：固有免疫细胞表达STING的强度，是STING活化后细胞是否被诱导凋亡的关键,a.CMA呈浓度依赖性降低CD4+T细胞活力（刺激过夜），但对BMDM无影响；b.随多西环素剂量增加，永生化巨噬细胞株受CMA刺激5h后，细胞活力呈多西环素浓度依赖性下降；c.在永生化巨噬细胞株中转染野生型小鼠STING和过度激活STING-V154M，予0.1g/ml多西环素刺激5h，表明STING过度激活其P-TBK1处于高表达状态；d.对过度激活的巨噬细胞株予0.1g/ml多西环素刺激5h和8h，可见其Ifnb1、Noxa、Puma均在5h表达达峰后下降，这是因为5h细胞开始死亡引起的；e.过度激活的巨噬细胞株予浓度逐渐升高的多西环素刺激过夜，随多西浓度增加，细胞活力显著下降。,增加巨噬细胞STING的表达强度，可以通过激活STING诱导巨噬细胞凋亡,Figure 6,激活STING可治疗T细胞淋巴瘤,科学问题：既然诱导STING高表达后再过度激活STING能诱导巨噬细胞凋亡，那么激活STING是否可诱导T淋巴细胞白血病死亡呢？,a.CMA刺激Cpc46和EL4 16h，随着CMA浓度增加细胞活力显著下降，wb表明Cpc46表达STING强度较EL4高，Cpc46对CMA应答也更敏感；b.Cpc46细胞予CMA刺激2-6h，表明p-TBK1、p-IRF3、Cl-caspase3均显著表达增加；c.CMA刺激Cpc46 4h后，其Ifnb1、Ifit2、Noxa、Puma mRNA显著表达升高；d. wt原代CD4+T(抗-CD3、抗-CD28扩增)，与GFP-Cpc46按1:1比例共培养，0.25mg/ml CMA培养0-2d，STING激活后显著降低Cpc46细胞数量，表明Cpc46白血病对STING活化后凋亡效应更显著；e.Cpc46细胞中转入含c-di-AMP、c-di-GMP、cGAMP的病毒颗粒，以上三者均能活化STING，都引起Cpc46细胞活力下降；f.含cGAMP的病毒颗粒在激活STING后同样显著诱导人T淋巴瘤、T白血病细胞凋亡；g.h.Cpc46和EL4对Rag-/-C-/-（T、B和NK敲除），CMA500g/d干预显著减少肿瘤体积；i、j.Cpc46和EL4对wt和STING-/-皮下成瘤，CMA瘤内注射干预后，均可降低肿瘤体积。,背景细胞株：小鼠急性T淋巴细胞白血病细胞Cpc46，EL4是淋巴瘤细胞；CUTLL1人T淋巴细胞瘤，DND41人急性淋巴细胞白血病细胞,总结：1.STING具有T细胞特异应答效应，并引起T细胞凋亡 2.其应答特异性与STING表达强度有关 3.STING特异性诱导T细胞凋亡，依赖于IRF3和P53调控BH3-结构域蛋白 4.STING非特异性应答固有免疫细胞，通过诱导其STING表达强度，可以产生 和T细胞一样特异性凋亡 5.在人和鼠T细胞淋巴瘤、T细胞急性白血病，激活STING可诱导细胞凋亡 揭示了其在血液病领域的应用前景,第二部分,Cutting Edge: Activation of STING in T Cells Induces Type I IFN Responses and Cell Death,Bridget Larkin,* Vladimir Ilyukha, Maxim Sorokin, Anton Buzdin,x,Edouard Vannier, and Alexander Poltorak*,J Immunol. published online 14 June 2017,这篇文章的补充数据下载不了,Figure 1,A.Wt的T细胞（CD3+T）比巨噬表达STING强度大；B. DMXAA刺激脾脏T细胞4h，引起CD3+T细胞呈现STING依赖性干扰素表达基因（ISGs）表达；C. DMXAA刺激CD3+T 4h后可诱导其表达IFN-和IFN-；D. cGAMP电穿孔5h后wt脾脏T细胞显著上调干扰素表达基因IFIT2（更搞笑地让cGAMP进入T细胞内）；F. CD4+T和CD8+T受DMXAA刺激后均能表达IFN-，但只有CD4+T表达IFN- mRNA；G. DMXAA诱导wt的T细胞磷酸化表达TBK1和IRF3，增加p-p38和p-p65表达,T细胞对STING应答后表达IFN mRNA,Figure 2,DMXAA抑制TCR增殖不依赖于IFN-I,Figure 3,STING