云南几种兰花菌根真菌的分离鉴定

7 5 6 西南农业学报 S o u t h w e s t C h i n a J o u rna l o f Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s 2 0 1 0年 2 3卷 3期 V0 L 2 3 Nn 3 文章编号 1 0 0 1 4 8 2 9 2 0 1 0 0 3 0 7 5 6 0 4 云南几种兰花菌根真菌的分离鉴定 段春芳 李枝林 方 飞 杨根华h 陈思思 洪群艳 1 云南农业大学植保学院 云南 昆明6 5 0 2 0 1 2 云南农业大学花卉研究所 云南 昆明6 5 0 2 0 1 3 云南省农业科学院热带亚热 带经济作 物研究所 云南 保 山6 7 8 0 2 5 摘要 从采 自云 南昆明的墨兰 文山红竹兰 大雪素 小雪素 惠兰 春绿兰 以及采 自丽江 保 山的小雪 素根 中分离到 1 2株真 菌 通过培 养性状 I T S序列分析鉴定得 出分离菌株分别属于镰 刀菌属 F u s a r i u m 丝核菌属 R h iz o c t o n ia 格孢腔 菌属 P te o s p o m 毛 壳菌属 C h o e t a r n i u m 柱孢属 C y l i n d r o c a r p o n 印 本文首次从采自云南的大雪素和小雪素中分离兰花菌根真菌 从墨兰中分离 到格孢腔 菌属 P l e o s p o r a 真菌在 国内未见报道 关键词 兰花 菌根菌 I T S序列分析 分离鉴定 中田分类号 6 8 2 3 1 文献标识码 A I s o l a t i o n a nd I d e nt i fic a t i o n Re s e a r c h o f M y c o r r hi z a l I s o l a t e d f r o m S e v e r a l Or c h i ds i n Yu n na n Pr o v i nc e DUAN Ch u n f a n g L I Z h i l i n F ANG F e i YANG Ge n h u a h C H E N S i s i H ON G Q u n y a h 1 C o l l e g e o f P l a n t P r o t e c t i o n Y u n n a n A g r i c u l t u r a l U n iv e r s i t y Y u n n a n K u n m i n g 6 5 0 2 0 1 C h i n a 2 I n s t i t u t e o f L a n d s c a p e P l ant s Y u rma n A c u l t u r a l U n i v e rsi t y Y u n n a n K u n m i n g 6 5 0 2 0 1 C h i n a 3 T r o p i c a l a n d S u b t r o p i c a l C a s h C r o p s R e s e a r c h I n s t i t u t e Y A A S Y u n n a n B ans h a n 6 7 8 0 2 5 C h i n a Al r a e t Tw e l v e i s o l a t e s w e r e o b ta i n e d f r o m s e v e l t e r r e s t r i a l o r c h i d s i n Yu n na n s i n e rt s e C l I 吼I 口 I 聃e s e C d l u e C靠 口 嘲熠 e C y mb i d i u m C 向 6 v a r s z e c h u a n l c u m a n d o rch i d s f o r m K u n mi n g We n s h an uj i ang and B a esh a n A c c o r d i n g t o t h e t est o f c u l tur a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d r DNA I TS q l l e n e e an a l y s i s T h e s e i s o l a t e s we l e c a t e g o riz e d as f o l l o ws Fu s a r i u m Rh iz o e t o n i a Pl e o s p o r a Ch o e t ar n i u m C y t i n d r o c a r p o n s p T h i sw a sfir s t r e p o r t o nt h a t Pl e o s p o r a W es i s o l a t e d f r o m C s i n e n s e Ke y wo r ds T e r m ina l o r c h i d My e o r r h i z a l f u n s i r DNA I TS s e q u e n c e a n a l y s i s I s o l a ti o n and i d e n t i fic a t io n 兰科 O r c h i d a c e a e 植物俗称兰花 全世界约有 7 0 0属 2 0 0 0 0多种及大量变种 主要分布于热带 亚 热带和温带地区 尤其南美洲和亚洲 的热带地 区为 多 兰科植物根据 生长环境的不 同可分为地生兰 附生兰和腐生兰 3 类 作为一种重要的观赏花卉和 药用植物资源 在花卉和天然药物产业上有着巨大 的经济价值和利用潜力 随着中药 现代化和兰 花产业的快速发展 目前对兰科植物资源的需求越 来越大 但人工栽培较为困难 组培苗移栽时成活率 低 生长缓慢 很难大面积推广 其 主要原因在于兰 花在短期 内无 法与相关的真菌形成菌根 J 兰科 收稿 日期 2 0 0 9一l 1 0 2 基金项目 云南省 自 然科学基金 2 0 0 6 C 0 0 3 1 Q 作者简介 段春芳 1 9 8 3 一 女 云南鹤庆人 在读硕士研究生 从事植物 真菌病 害研 究 为 通讯 作 者 E m a il g h y ang 2 0 13 0 y a h e o c o rn 菌根真菌对于兰科植物有着重要的意义 在 自然状 态下 只有真菌与兰科植物种子或根形成共生 的菌 根 关 系后 兰科 植 物 才 能 正 常 地 萌发 和生 长 发 育 引 1 8 8 5年 F r a n k提出了 菌根 M y c o r r h i z a 这一 术语来描述植物与真菌的共生联合体 由此菌根研 究开始迅速发展 菌根是土壤中的一类真菌与植物 根系之间所形成的互惠互利的共生联合体 L i n k 首先证实了兰科植物根中存在着真菌 4 J 之后 兰 科植物与菌根关系得到证实 并进行 了广泛研究 1 9 0 3年 B e rna r d 首次报道 了真菌和兰科植物种子 萌发的关系 B u r g e ff对真菌和兰科种子研究得出 兰科种子在真菌的侵染下萌发 他分离并命名了许 多真菌 发展了消化真菌作为兰科植物生长营养来 源的重要理论 之后 国内外相继大量开展 了兰科菌 根真菌与兰科植物之间的关系的研究 3期 段春芳等 云南几种 兰花菌根真菌的分离鉴定 7 5 7 1 材料 与方法 1 1 材 料采 集 从云南农业大学园林园艺学院花卉研究所采集 大雪素 小雪素 文山红竹兰 墨兰 春绿兰以及从丽 江 保 山采集小雪素 选择健壮的兰根 从兰花根中 分离菌根菌 1 2 兰花菌根徒手切片 常规徒手切片法 并在显微镜下观察拍照 1 3兰花茵根菌的分离纯化 采用常规切片组织分离法 1 4 分离菌株的形态学鉴定 根据其形态特征 初步鉴定分离菌株所属 1 5菌根菌的 5 8 s r D N A I T S克隆与测序 引物为 I T S 1和 I T S 4 M J 扩增反 应在 P C R 仪 P e r k i n E l m e r 上进行 P C R反应体系为 5 0 l 如 下 P C R循环 9 4 o C 预变性 3 m i n 循环 1次 9 4 变 性 1 m i n 5 1 退火 1 m i n 7 2 c C延伸 1 mi n 3 0次循 环 最后 7 2 延伸 1 0 ra i n P C R产物用 1 琼脂糖 凝胶电泳检测 P C R扩增产 物用 大连宝生物提供 的试剂盒进行纯化 纯化产物可直接测序 备用 质 粒载体 p G E M T e a s y与 P C R纯化产物连接反应 转 化 由 C o h e n 1 等冰冷氯化钙法制备 的 D H 5 c t 感受态 细胞 经红一 白斑筛选后进行重组质粒 P C R 最后选 取阳性重组子送上海生工进行测序 1 6 序列分析 利用 B i o x m D N A MA N和 B L A S T等软件分 析 与 G e n B a n k中登陆的已知序列进行同源性 比较 2 结果与分析 2 1 兰花根切片观察 在所采集的兰花根部的切片上能看见缠绕一块 的菌丝团 图 1 菌丝团的出现表明真菌和兰科植 物产生共生关系 图1 兰根内茵丝团 F i g 1 Th e e n d o c e l l a r h y ph a l c i l o f o r c h i d s 2 2 分离菌株的鉴定结果 L j 1 菌株和 K m 1 1 8菌株培养性状具有典型 的 丝核菌特征 显微镜下观察到菌丝直角或锐角分支 分支处有 缢缩 现象 其 中经 菌丝融 合技 术鉴 定 K m 1 1 8为立枯丝核菌 A G G 小雪素 中分离出来 的 K m 1 4 7菌株在 P D A上为粉红色 边缘菌丝为 白色 显微镜下观察菌丝多分枝 有镰刀型分生孢子 经鉴 定为镰刀菌属 F u s a r i u m真菌 大雪素 中分 离 出来 的 K m一 1 4 6 3菌株显微镜下观察菌丝为灰绿色 营养 体为有隔膜的菌丝体 经鉴定为毛壳菌属 C h o e t a r n i i l l T t 大雪素中分离出来 的 K m 1 4 6 1菌株经 I T S克 隆测序为 5 8 7 b p B L A S T比对后 该 分离菌株属 于 柱孢属 K m 1 1 7菌株用 P C R纯化产物 直接测序 B L A S T比对后属于格孢腔菌属 L j 2菌株经 I T S克 隆测序为 5 4 5 b p 比对后属于镰刀菌属 K m一 1 5菌 株用 P C R纯化产物直接测序 B LA S T比对后属于镰 刀菌属 其余分离菌株鉴定结果详见表 1 部分分离 菌株 D N A 重组质粒 I T S扩增 电泳图见图 2 其 目 的 条 带 大 小 均 为 5 0 0 7 5 0 b p 其 中 M D I 20 0 0 M a r k e r 1 K m一 1 5的 D N A P C R 电泳 2 K m一 1 1 8的 D N A P C R电泳 3 L j 2重组质粒 D N A P C R 电泳 4 K m一 1 1 7的 D N A P C R电泳 5 K m一 1 4 6 1的 重组质粒 D N A P C R电泳 2 3 序列同源性分析 从图 3中可 以看 出 K m l 1 7菌株与 G e n B a n k 中的序列 登录号 0 Q 6 8 2 5 9 8 1 同源性是 9 8 9 9 结合分离菌 株的形态特 征 K m一 1 l 7属 于格孢腔菌 属 K m 1 4 6 一 l与 G e n B a n k 中 的 序 列 登 录 号 F J 6 0 5 2 5 9 1 同源性是 9 9 属于柱孢 属 L j 2与 G e n B a n k中的序列 登录号 E U 5 4 3 2 1 1 G Q 3 5 2 4 9 2 1 G Q 3 6 5 1 5 6 1 同源性是 1 0 0 并 与 K m 1 5同源 性为 9 9 都属于尖孢镰刀菌 M 1 2 3 4 5 7 5 0 b p 一 5 0 0 b p 一 图 2 D N A P C R 重 组质粒 DN A 扩增 电泳 图 F i g 2 P G R a m p l i fi c a t i o n o f D N A r e c o mb i n a n t p l a s mi d o f t e s t e d i s o l a t e s 7 5 8 西南农业学报 2 3卷 1 o 0 9 9 8 8 7 5 9 6 7 0 6 6 6 0 6 图3 菌株的5 8 S r D NA I T S序列同源性分析树 F i g 3 Ho mo l o g i e a l t r e e c o n s t r u c t e d b y a n a l y s i s 5 8 S r DNA I TS n u c l e o ti d e s e q u e n c e s f r o m t e s t e d s t r a i n s 3 讨 论 从所采集的兰花根中分离到 1 2株真菌 通过形 态特征和分子生物学鉴定 分离菌株集 中在半知菌 亚门和子囊菌亚门 从表 2看出 分离菌株中镰刀 菌和丝核菌 比例较大 这和相关报道 中丝核菌和镰 刀菌占优势相一致 2 0 0 0年郭顺星等从中国 云南 四川等地采集 的野生石斛 品种上分离到内柱 孢属的真菌 1 范黎等在寒兰 C y m b i d i u m k a n r a n 麦 穗 石 豆 兰 B u l b o p h y U u m c a r e y a n u m 长 叶 兰 C y m b i d i u m e r y t h r a e u m L i n d 1 曲轴石斛 D e n d r o b i u m g i b s o n i i L i n d 1 蝶兰 P h a l a e n o p s is w i l s o n i i 中分 离到柱孢属真菌 J 在本文中 从采 自昆明的大雪 素中同样分离到柱孢属真菌 已报道从墨兰中分离 到的真菌有木霉属 2 1 1 My c e l i a s t e r i l e g r o u p B 2 小 姑属 J 而在本文 中 从 墨兰中分离到格孢腔菌属 真菌 这在国内未见报道 大雪素 小雪素都属于连 瓣兰 主产地是云南 是云南 四大传统名品之首 首 次从云南不同地方 的大雪素 小雪素 中分离 到共生 菌 分离到的菌有丝核菌属真菌 镰刀菌属真菌 毛 壳菌属真菌 柱孢属真菌 实验中采用 P C R纯化产物直接测序和克 隆测 序 采用克隆测序 的 L j 2与 G e n B a n k中的序列 同 源性为 1 0 0 K m一 1 5用扩增产物直接测序 结果 与 L j 2的同源性只有 9 9 从结果表明克隆测序较准 确 K m 一 1 4 6 2菌株经 I T S克隆测序 B L A S T比对 后 该分离菌株和双核丝核菌同源性较高 但未能确 定出具体群 对于传统的真菌形态学鉴定方法 r D N A I T S 序 列分析用于真菌鉴定更客观 省时 简便 快速 但受 基因库完善程度 高度同源性序列的多少 以及具体 物种 I T S区的可变程度等影响 并不能鉴定 出所 有 真菌 目前 兰花的工厂化生产多采用组织培养法扩 繁 繁殖过程中 组培苗易受有害微生物污染 缺乏 生长所需营养 在兰科菌根真菌 的应用中 用接种 菌根真菌的方法作为促进兰科植物种子胚的萌发和 萌发后的生长发育的一种途径 提高组培苗出瓶的 成活率 这对兰花的栽培是一个很有发展前景的措 施 参考文献 1 罗毅波 贾建生 王春玲 等 中国兰科植物保育的现状和展望 J 生物多样性 2 0 0 3 1 1 1 7 0 7 7 2 郭顺星 徐锦堂 真菌在兰科植物种子萌发生长中的作用及相互 关系 J 作物学通报 1 9 9 0 7 1 1 3 1 7 3 吴应祥 中国兰花 第二版 M 北京 中国林业出版 1 9 9 3 6 5 76 3期 段春芳等 云南几种兰花菌根真菌的分离鉴定 7 5 9 4 R e s s i c k S O b e r e n d o p h y t e n d e r p fl a n z e n z e l l e J N a t u r w i s s 1 8 4 7 1 3 1 4 6 5 Z c l m e r C D C u r r a h R S C e r a t o r h iz a p e r n a c a t e n a a n d E p u l o r h i z a c a l e n d d in a s p p l D l M y e o r r h i z a l f u n o f t e r r e s t r i a l o r c h i d s J C ana d i a n J o u r n a l o fB o t a n y 1 9 9 5 7 3 I 2 1 9 8 1 1 9 8 5 6 丁晖 几种兰花内生真菌的筛选 M 南京 南京林业大学 2 o 01 1 3 3 6 7 C u r r a h R S S h e r b u m e R S e p t al u l t r a s t u c tu r e of s o m e f ll n g 8 l e n d o p h y t e s f r o m b o r e a l o rch i d my c o r r h i z a s J My c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 9 9 2 9 6 5 8 3 5 8 7 8 C u r r a h R S Z e l m e r C D S i s h t L e t a 1 N e w r e c o r d s a n d n e w t a x a o f f n s l f r o m t h e m y c o r r h i z a e of t e r r e s t r i a l o r c h i d s o f A l b e r t J C a n J B o t 1 9 8 7 6 5 2 4 7 3 2 4 8 2 9 T a y l o r D L B ra n s T D H e d g e s S A E v i d e n c e f o r m y c o r r h i z a l r a c e s i n a c h e a t i n g o rch i d J P r o c B i o l S c i 2 0 0 4 2 7 1 1 5 3 4 3 5 4 3 1 O 范黎 郭顺 星 肖培根 密花石斛 等六种兰科植物 菌根 的显微 结 构研究 J 植物学通报 2 0 0 0 1 7 1 7 3 7 9 1 1 颜容 刘红霞 蔡怀烦 等 独花兰菌根的初步研究 J 北京 林业大学学报 2 o 0 6 2 8 2 l l 2一I 1 7 1 2 胡陶 李潞滨 杨凯 等 中国兰属植物菌根真菌的分离鉴 定 J 北京林业大学学报 2 0 0 8 3 0 3 1 3 2 1 3 5 1 3 Wh i t e T J B r u n s T L e e S A n al y s i s o f p h y t o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s b y a mp l i fi c a t i o n and d i r e c t s e q u e n c i n g of r i b o s o m al R NA g e n e s A I n i n n i s M A