细菌内毒素检查

细菌内毒素检查,王文洁,一、试剂及仪器,注射用头孢他啶鲎试剂（标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（BET水），仪器（严格消毒）,质量标准：中国药典（2005年版）第二部 p135细菌内毒素检查法：附录,二、实训内容,1.细菌内毒素标准溶液的制备,150151.0 0.5 0.25 0.125,0.21.8BET,0.22.8BET,0.90.9BET,0.90.9BET,0.90.9BET,2 0.5 0.25,供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVDCLC - 为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml） L - 为供试品的细菌内毒素限值，EUml - 鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）,2.供试品溶液的制备,PC阳性对照2内毒素溶液PPC供试品阳性对照含2内毒素溶液的供试品NC阴性对照BET水,3.对照,4.检查,SPCPPCNC 各两支,将安瓿瓶中溶液轻轻混匀后，封口膜封口，垂直放入371水浴中，保温602分钟。,细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。,美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。我国药典至2005年版正式收载了需“细菌内毒素检查法”品种达234种。,细菌内毒素检查鲎试剂法,2005版中国药典二部收载的细菌内毒素检查法部分品种表,2005版中国药典三部收载的细菌内毒素检查法部分品种表,鲎试剂法优点,快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品。鲎试剂法局限性对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。,（鲎变形细胞溶解物）,凝固酶,内毒素、Ca2+,原理,活化的B因子,LAL中的B因子,凝固酶原,凝固原(可凝性蛋白),凝固蛋白（凝固素),凝胶,细菌内毒素检查可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除有专门说明外，以凝胶法结果为准。,细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法光度测定法:包括浊度法和显色基质法,概述,1.抗生素（antibiotics） 在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,3.来源,生物合成（发酵） 化学合成或半合成,4.特点,化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差,5.抗生素质量分析生物学法、物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等 含量/效价测定： 微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差,内酰胺类,氨苄西林,阿莫西林,青霉素（苄青霉素）（penicillins）,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,氢化噻唑环,氢化噻嗪环,母核：6氨基青霉烷酸,母核：7氨基头孢菌烷酸,结构与性质,1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。,2.手性C （旋光性）,3.UV,青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构,260nm,4. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ),干燥条件较稳定，溶液不稳定,某些氧化剂、金属离子、温度,Identification,(三)呈色反应,1）羟肟酸铁反应内酰胺环,2）茚三酮反应-氨基,(红、棕、褐),3）双缩脲反应内酰胺类,4）变色酸-硫酸反应,5）重氮苯磺酸反应酚羟基,（偶合）,6）铜盐反应头孢氨苄的专属反应,7）硫酸-甲醛反应(BP),青霉素钾和青霉素钠呈红棕色,(四)焰色反应K+、Na+,Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等),头孢他啶中聚合物测定,萄聚糖凝胶立体网状结构图,原理“分子筛”,氨基糖苷类,氨基环醇+氨基糖苷,链霉素(Streptomycin),巴龙霉素(paromomycin),D-葡萄糖胺脱氧链霉胺,巴龙胺,D核糖巴龙霉糖,巴龙二糖胺,庆大霉素(gentamycin),绛红糖胺,(紫素胺),2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺),Identification,坂口反应,麦芽酚反应,N-甲基葡萄糖胺反应,N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,红色,乙酰丙酮,OH-,麦芽酚反应链霉糖特有反应,H+,坂口反应链霉胍特有反应,四环素类,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,结构与性质,1）两性： -OH酸性 N(CH3)2碱性,Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光,与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度,2）旋光性3）UV和荧光 4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基),弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,5）不稳定性,A.差向异构化,蓝色荧光,淡黄黑,（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）,B.酸性脱水降解,max = 445nm,max = 435nm,C.碱