黄酮类成分分析

,黄酮类成分分析,一、结构特征及理化性质结构特征 基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）理化性质物理性状结晶性固体或无定形粉末。大多数呈黄色，其颜色的有无与交叉共轭体系有关。如：黄酮、黄酮醇及其苷类多呈黄色；二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄烷醇呈无色；异黄酮呈无色或微黄色。溶解性,游离苷元易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶及稀碱水黄酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂,酸碱性酸性：与酚羟基的数目和位置有关 7,4- 二羟基 7或4- 羟基 一般酚羟基 5-羟基碱性：r-吡喃酮环上的1-位氧原子，可表现出微弱碱性显色反应 还原反应（盐酸镁粉反应） 与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐） 硼酸显色反应碱性试剂反应 五氯化锑反应 Gibbs反应和Emerson反应光谱特征 I带(300-400nm) B环桂皮酰基 II带(240-285nm) A环苯甲酰基,色谱法 1.薄层色谱法硅胶-分离鉴别弱极性黄酮类化合物遵循正相色谱原理，化合物极性越大，所选择的展开剂极性也相应增大，同时根据化合物酸性强弱调节展开剂的酸碱性。常用展开剂有苯-甲醇等。聚酰胺-分离检识含游离酚羟基的黄酮及其苷利用氢键吸附原理，由于聚酰胺和黄酮类化合物上酚羟基形成氢键缔合，所以作用力较强，需要极性强的展开剂，而在展开剂中大多含有醇、酸或水，或兼有两者。所以，分离检识游离黄酮常用有机溶剂作为展开剂，如氯仿- 甲醇等；而分离检识黄酮苷常用含水有机溶剂作为展开剂，如甲醇- 水等。纤维素-分离黄酮类多糖苷混合物展开系统：正丁醇-乙酸-水，5%40%乙酸 展开好的色谱，常在紫外灯（365nm）下观察荧光斑点及其颜色；亦可喷三氯化铝试剂，在日光灯或紫外灯下观察荧光是否加强；也可氨熏，是否出现黄色、棕色荧光斑点等。,2.纸色谱法 适用于分离各种类型的黄酮化合物，包括游离黄酮和黄酮苷类。 混合物的检识常采用双向色谱法，第一向采用醇性展开剂如正丁醇-乙酸-水（4:1:5上层，BAW）等，此为正相分配色谱，极性小的化合物比极性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展开剂，如水、 2%6%乙酸等，其色谱行为类似于反向色谱，极性大的化合物比极性小的化合物Rf值大。 游离黄酮类化合物的检识，一般宜用醇性展开剂；花色素及花色苷的检识可用含盐酸或乙酸的水溶液作展开剂。 多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外灯检查时，可以看到有色点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外，还可以喷以2%AlCl3甲醇溶液（在紫外灯下检查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液等显色剂。,三、含量测定 中药制剂中含有黄酮类成分，可按要求测定总黄酮含量、黄酮类单体含量或两者均须测定。含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。（一）、总黄酮含量测定 1.分光光度法一般用于总酮类成分的含量测定。大多数黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。 带出现在300400nm之间的吸收带 带出现在240285nm之间的吸收带 含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经必要的提取纯化后，可直接于最大吸收波长附近测定总黄酮的吸光度，对照品的选定应以最大吸收波长与总黄酮的相近为原则，单体黄酮和总黄酮均可作为对照品，常以芦丁等对照品计算总黄酮的含量。中国药典2015版中淫羊藿总黄酮的含量测定（书P156页）,2 .铝盐配位比色法 本法采用分光光度法测定中药中黄酮类成分，若供试液中其他组分的吸收存在干扰，可进行比色测定。该法利用黄酮类成分与铝盐发生配位反应，生成的配合物与背景最大吸收波长差别较大，可消除背景（即阴性空白）的干扰，显著提高含量测定的选择性。（1）硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法 将中药通过适当方法制成供试液 加5%亚硝酸钠反应6min 10%硝酸铝反应6min 4%氢氧化钠反应15min 生成红色配合物后在500nm测定，常用芦丁作为对照品。 （：该法是基于邻二酚羟基的反应，并非黄酮类化合物的专属反应。）垂盆子颗粒中总黄酮含量测定铝盐配位比色法（见书156页）（2）三氯化铝醋酸钾比色法 常用芦丁为对照品，采用三氯化铝醋酸钾为显色剂，显色后在420nm波长处测定黄酮类成分含量。 (p S:黄酮类化合物与三氯化铝醋酸钾反应后最大吸收波长并不一定都 在420nm处，因此，最好用所含黄酮作对照品） 消咳喘糖浆中总黄酮含量测定-铝盐配位比色法 见书p157页,（二）、单体黄酮含量测定薄层扫描法样品经适宜的溶剂提取得到供试液，经硅胶、聚酰胺或纤维素薄层 色谱有效分离后，用薄层扫描仪直接进行含量测定。对黄酮类单体 既可以进行紫外-可见光扫描，又可以进行荧光扫描。高效液相色谱法正相色谱(多用于没有羟基或乙酰化黄酮类成分化合物） 固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。反相色谱（C18或C8） 固定相多为十八烷基硅烷键合相 流动相：甲醇-水-乙酸（磷酸缓冲液），乙腈-水检测器：紫外检测器或荧光检测器,银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定 含量测定色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离度应大于1.5。 对照品溶液的制备（略） 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约相当于总黄酮醇苷19.2mg的粉末，精密称定，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置100ml锥形瓶中，加甲醇10ml、25%盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45m）滤过，取滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮苷的含量。 总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量）2.51,常见的黄酮类成分分析 p158p159,中药名称:葛根成分: 葛根素定性鉴别方法：取本品粉末0.8g，加甲醇10ml，放置2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取葛根对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各10l，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。理化特征：溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，三氯甲烷或乙醚中不溶。Mp:187（分解）UV:254nm常用分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法,中药名称：槐花 成分：芦丁定性鉴别方法：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，密塞，振摇10分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。理化性质：易溶于碱水；可溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶；微溶于丙酮、乙酸乙酯；难溶于冷水、苯、乙醚、三氯甲烷。Mp:177178 ;UV:259,266,299,359nm常见分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法,中药名称：黄芩成分：黄芩苷定性鉴别方法：取本品粉末1g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1）的混合溶液30ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg、0.5mg、0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各2l及上述三种对照品溶液各1l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点。 理化性质：易溶于二甲基甲酰胺、吡啶，微溶于热冰乙酸、碳酸氢钠和氢氧化钠等溶液，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，几乎不溶于水、乙醚、苯、三氯甲烷。Mp:233 UV:242,272,310nm常见分析方法：HPLC,TLCS,中药名称：淫羊藿 成分：淫羊藿苷定性鉴别方法：取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，温浸30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液和含量测定淫羊藿苷项下的对照品溶液各10l，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝试液，再置紫外光灯（365nm）下检视，显相同的橙红色荧光斑点。 理化性质：溶于乙醇、乙酸乙酯，不溶于醚、苯、三氯甲烷。Mp:231232 UV:272nm常见分析方法：HPLC;TLCS,中药名称：陈皮成分：橙皮苷定性鉴别方法：取本品粉末0.3g，加甲醇10ml，加热回流20分钟，滤过，取滤液5ml，浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各2l，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100：17：13）为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20：10：1：1）的上层溶液为展开剂，展至约8cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 理化性质：在60溶于二甲基酰胺及甲酰胺。略微溶于甲醇及热冰醋酸，几乎不溶于水，丙酮、苯及三氯甲烷。而易溶于稀碱及吡啶。Mp:258262 UV:284nm常见分析方法：HPLC;TLCS,中药名称：银杏叶 成分：槲皮素定性鉴别方法：取本品粉末1g，加50%丙酮溶液40ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加15%乙醇5ml使溶解，加入已处理好的聚酰胺柱（3060目，1g，内径为1cm，用水湿法装柱）上，用5%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸去乙醇，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品及白果内酯对照品，加丙酮制成每1ml各含银杏内酯A0.5mg、银杏内酯B0.5mg、银杏内酯C0.5mg、白果内酯1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各51，分别点于同一用4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层