细菌鉴定的一般步骤ppt课件.ppt

细菌鉴定的一般步骤 办公室 综合楼B419邮箱 一 确保菌株的纯度 在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度 假若菌株没有纯化好 将会做大量的无用功 二 PCR扩增16SrRNA片段 菌落直接PCR菌体新鲜 加菌量少 阴性菌较阳性菌容易 退火温度要高点DNA扩PCR高盐法或CTAB法提取细菌总DNADNA量不要加太多 三 16SrRNA片段测序 PCR产物直接测序条带特异 注意产物的浓度要足够 不要纯化PCR产物克隆测序挑单菌落 菌液测序或质粒测序 四 系统发育树的构建 首先将所获得的16SrRNA片段序列在NCBI数据库中进行序列的比对 序列提交GenBank获得登录号 从相关数据库下载相关模式种16SrRNA片段序列采用MEGA软件邻近法做树 核酸序列数据库 现在比较通用的核酸序列数据库有 Genbank nationalinstitutesofhealth RDP EMBL Europeanmolecularbiologylaboratory DDBJ DNAdatabankofJapan 五 发育树的构建及作用 确认目标菌株跟模式菌株间的遗传距离确认目标菌株的分类定位同源性较低 认定可能为新种或新属 有必要重新扩增序列克隆测序 六 序列同源性差异分析 16SrRNA序列同源性在大于97 慎重考虑16SrRNA序列同源性在97 以下有做新种的意义16SrRNA序列同源性在95 以下有可能是新属 新属的判定依据 16SrRNA序列同源性在95 以下拥有该科的共有特性与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异生理生化差异明显极性脂成分有差异注意 判定依据要根据实际情况而定 七 几个发育树例子的分析 地衣芽孢杆菌模式种的生理生化特性 分类在一个支上 同源性大于99 初步判定为地衣芽孢杆菌生理生化特性的分析等DNA杂交 实际情况而定 确定菌株种属 首先确定菌株属的定位 与同属模式菌株数据的比较 查阅文献到IJSEM杂志阅读邻近种属的分类文章 形态学分析 菌落形态 菌株wd的LB平板菌落照片 菌体照片间的比较 菌株wd扫描电镜照片 Starkeyakoreensis Lmetal IJSEM 2006 56 2409 2414 Ancylobacterrudongensis IJSEM 2004 54 385 388 Angulomicrobiumamanitiforme IJSEM 2004 54 651 657 生理生化性质 IJSEM 2004 54 651 657 选择模式种进行实验 菌种15561Angulomicrobiumamanitifo培养基编号 1830菌种5895Angulomicrobiumtetraedrale培养基编号 628菌种18406Starkeyanovella培养基编号 830菌株送国际菌种保藏中心保藏 细胞壁脂肪酸 与模式种同步试验 测定G C含量 DNA DNA杂交同源性测定 API实验进行生理生化的特性的获得 Biolog 鉴定系统进行糖代谢的特性研究 生理生化特性总结 Lmetal