8.PCT主要生产工艺及反应体系的研究资料

广州鸿琪光学仪器科技有限公司 1 降钙素原 降钙素原 PCTPCT 检测试剂盒 胶体金法 检测试剂盒 胶体金法 主要生产工艺及反应体系的研究资料 胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一 广州鸿琪光学科技有限公 司结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了降钙素原 PCT 定量 检测试剂盒 胶体金法 结合鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪对血清 血浆和全血标 本中的降钙素原 PCT 进行定量检测 一 一 反应原理描述反应原理描述 人降钙素原 PCT 检测试剂 胶体金法 是一种不需要任何仪器设备的全血 血清 血 浆检测法 采用胶体金免疫层析技术 试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维上的胶体金标记 的抗PCT单克隆抗体 mAb1 以及固定于膜上测试区 T 的抗PCT单克隆抗体 mAb2 和质控区 C 的相应抗体 测试时 将标本滴入试剂盒加样孔 S 内 标本中如含有人降钙素原 PCT 则标 本中的人降钙素原 PCT 分别与预先包被在玻璃纤维上的抗PCT单克隆抗体 mAb1 结合 结合物在毛细效应下向上层析 随后会被固定在膜上相应测试区的抗PCT单克隆抗体 mAb2 结合捕获 从而在相应测试区出现紫红色条带 如是阴性标本 则相应测试区内将没有紫 红色条带出现 无论标本中是否存在人降钙素原 PCT 一条紫红色条带都会出现在质控 区 C 内 质控区 C 内所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本 层析过程是否正 常的标准 同时也作为试剂的内控标准 通过金标免疫分析仪检测测试区 T 显色深度 再经过保存在卡壳上二维码上的定标曲线计算得到检测结果 胶体金标记的基本原理是胶体金在弱碱环境下带负电荷 可与蛋白质分子的正电荷基 团形成牢固的结合 由于这种结合是静电结合 所以不影响蛋白质的生物特性 胶体金标记所用的主要原辅料有 抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 氯金酸 柠檬酸三钠 玻 璃纤维 NC 膜包被的基本原理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合 然后靠 H 键和疏 水作用维持长时间结合 NC 膜包被所用的主要原辅料有 硝酸素纤维膜 抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 和羊抗鼠 IgG 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 2 二 主要生产工艺的各主要工序流程图二 主要生产工艺的各主要工序流程图 蓝色工序在 10 万级洁净区内进行 其他工序在普通生产区 Yes Yes Yes NO 领 料 标记 晾 干 入 库 喷 金 入 库 半成品检验 配包被溶液 配标记用液体 稀释金标交联溶液 包 膜 配包被用液体 不合格品控制 半成品检验 No 不合格品控制 干 燥 组 装 NO o 放 行 成品检验 不合格品控制 总 装 定 标 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 3 三 主要工序所用主要原辅料 具体步骤即每一步骤的具体实现方法三 主要工序所用主要原辅料 具体步骤即每一步骤的具体实现方法 该产品的生产工艺包括各种工作溶液的配置 胶体金标记物 包被抗原或抗体等浓度 确定 胶体金标记物制备 检测线及质控线的制备等步骤 并通过产品的半成品检验和成 品检验两个质控过程来保证其质量符合产品质量标准 一 各种工作溶液的配置 1 配标记用液体 胶体金制备 0 01 氯金酸 HAuCl4 水溶液 100ml 加热至沸腾 加入 1 柠檬酸三钠 1ml 混匀 煮沸 5 分钟 待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后 冷却即可 2 配金标记物干燥基础液 包被缓冲液为 10mM Tris HCl 1 0 BSA 0 01 NaN3 2 蔗糖 3 配包被用液体 包被缓冲液为 10mM Tris HCl 2 蔗糖 4 配包被溶液 对照线包被羊抗鼠 IgG 包被浓度 1 0mg ml 检测线分别包被抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 包被浓度均为 1 0mg ml 喷量 1 0 l cm 电机速度511HZ 二 胶体金标记物 包被抗原或抗体等浓度确定 1 胶体金标记物 分别以 20ug ml 最终浓度将抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 加入胶体金溶液 中进行标记 2 检测线包被抗原浓度 用包被缓冲液稀释抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 终浓度均为 1 0mg ml 3 对照线包被浓度 用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG 终浓度为 1 0mg ml 三 胶体金标记物的制备 采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金 选择 30nm 胶体金颗粒用于标记 分别以 20 g ml 最终浓度抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 加入胶体金溶液中 快速搅拌 1 分钟 再慢速搅拌 15 分 钟 分别加入 20 BSA 搅拌 5 分钟 离心 6 分钟 4000 转 吸去上清 沉淀以金标记 物干燥基础液 原胶体金溶液体积的 1 10 重新悬浮 置 2 8 保存 在规定的保存期内 使用 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 4 以金标记物干燥基础液对金标抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 进行按一定比例稀释 然后利 用喷金仪喷到玻璃纤维上 喷量 1 0 l cm 喷笔口径为 10mm 将喷好的玻璃纤维放置烘 房中 37 2 干燥 24 小时 四 检测线及质控线的制备 取抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 终浓度分别为 1 0mg ml 喷量 1 0 l cm 电机速度511 在硝酸纤维素膜上制备检测线 室温干燥 取已确定使用的用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG 终浓度为 1 0mg ml 用同样方法制备控制线 检测线与控制线在 NC 膜上之间的距离 约 3 5 0 5mm 线的宽度约 0 8 1 0mm 前后均匀 并置温度 15 26 温度 30 干燥 24 小时以上 五 半成品检验 按批号抽取一定数量的半成品检测 对所抽样的半成品做准确性 最低检出量 线性 精密性 稳定性等性能方面的检测 应符合质量标准 六 贴板 切条 装卡 在 温度 15 30 湿度 25 条件下 将标记好的玻璃纤维 硝酸纤维膜 聚纸板 吸 水纸 样品垫 经特殊处理 可过滤红细胞 等物组装 要求材料附着牢固 膜条切割应 宽为 4 0 1 0mm 然后装塑料壳 七 定标 利用公司内部校准品对试剂进行定标 定标曲线保存到二维码中 八 组装 1 把二维码贴到试剂卡壳上 并将干燥剂 吸管等装入铝箔袋 封口 2 装盒 九 成品检验 成品做准确性 最低检出量 线性 精密性 稳定性等性能方面的检测 应符合质量 标准 四 主要工艺的确定四 主要工艺的确定 1 检测线包被浓度 试验设计 固定加液量 喷量 1 0 l cm 电机速度511HZ 用包被缓冲液调整抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 的包被浓度分别为 0 3 mg ml 0 5 mg ml 1 0 mg ml 2 0 mg ml 分别进行包被 晾干后按正常生产工艺组装试剂条 分别以降钙素原最低检出量参考品 0 1ng ml 和零浓度参考品加样测试 每个浓度参考品平行测试 20 次 计算零浓度参考 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 5 品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD 计算 0 1ng ml 参考品的测试 平均值为 M1 若 M1 M0 2SD 表明最低检测限 0 1ng ml 95 置信区间 试验结果 包被浓度M0 2SD M1 0 3mg ml 0 5mg ml 1 0mg ml 2 0mg ml 2 5mg ml 结论 当包被浓度分别达到 1 0mg ml 最低检测限 0 1ng ml 而进一步提高包被浓 度 这个项目的灵敏度没有明显的改变 最终确定这个项目检测线包被浓度均为 1 0 mg ml 2 对照线包被浓度 试验设计 固定加液量 喷量 1 0 l cm 电机速度511HZ 用包被缓冲液调整羊 抗鼠 IgG 抗体浓度为 0 4 mg ml 0 8 mg ml 1 0 mg ml 1 4 mg ml 1 8mg ml 分别进行 包被 晾干后按正常生产工艺组装试剂条 以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色 时间 试验结果 羊抗鼠 IgG对照线显色时间 0 5mg ml超过 4 min 0 8mg ml超过 4 min 1 0mg ml2min 1 5mg ml2min 2 0mg ml2min 结论 包被浓度达到 1 0mg ml 对照线即在 2 min 内清晰可辩 符合设计要求 最终 确定对照线包被浓度 1 0mg ml 3 胶体金标记抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 的制备 3 1 胶体金与标记蛋白用量之比的确定 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 6 试验设计 将胶体金分装 15 管 每管 1ml 每个项目 5 管 将抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 分别以 5 g ml 10 g ml 20 g ml 30 g ml 40 g ml 浓度加入上列胶体金溶液中 快速搅拌 1 分钟 再慢速搅拌 15 分钟 加 20 BSA 搅拌 5 分钟 离心 6 分钟 10000 转 吸去上清 沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮 以金标记物干燥基础液对金标抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 进行按一定比例稀释 然后利 用喷金仪喷到玻璃纤维上 喷量 1 0 l cm 喷笔口径为 10mm 将喷好的玻璃纤维放置烘 房中 37 2 干燥 24 小时 按正常生产工艺组装试剂条 分别进行包被 晾干后按正常生产工艺组装试剂条 分别以降钙素原最低检出量参考 品 0 1ng ml 和零浓度参考品加样测试 每个浓度参考品平行测试 20 次 计算零浓度参考 品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD 计算 0 1ng ml 参考品的测试 平均 M1 若 M1 M0 2SD 表明最低检测限 0 1ng ml 95 置信区间 比较不同标记 蛋白用量的灵敏度高低 包被浓度M0 2SD M1 0 3mg ml 0 5mg ml 1 0mg ml 2 0mg ml 2 5mg ml 结论 当标记浓度分别达到 20 g ml 试剂盒能满足最低检出量参考品 0 1ng ml 检出 要求 而进一步提高包被浓度 这三个项目的检测线显色程度没有明显的改变 最终确定 标记浓度均为 20 g ml 3 2 金标抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 稀释浓度的确定 试验设计 将抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 用金标记物干燥基础液按 1 1 1 2 1 3 比 例进行稀释 稀释好后按固定喷金参数 将金标抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 喷在 玻璃纤维上 干燥 按正常生产工艺组装试剂条 分别以降钙素原最低检出量参考品 0 1ng ml 和零浓度参考品加样测试 每个浓度参考 品平行测试 20 次 计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD 计算 0 1ng ml 参考品的测试平均 M1 若 M1 M0 2SD 表明最低检测限 0 1ng ml 95 置信区间 比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 7 稀释浓度M0 2SD M1 1 1 1 2 1 3 结论 只有当稀释度达到 1 1 时 最低检测限 0 1ng ml 符合设计要求 最终确定 金标单抗稀释度为 1 1 4 设计定型 通过以上实验 我们确定采用的生产工艺为 1 NC 膜包被 检测线 用包被缓冲液稀释抗 PCT 单克隆抗体 mAb2 到终浓度为 1 0mg ml 对照线 用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG 终浓度为 1 0mg ml 包膜参数 喷量 1 0 l cm 电机速度511HZ 将包被好的 NC 膜放置烘房中 37 2 干燥 24 小时 2 胶体金标记 以 20 g ml 最终浓度将抗 PCT 单克隆抗体 mAb1 加入胶体金中 快速搅拌 1 分钟 再 慢速搅拌 15 分钟 加 20 BSA 搅拌 5 分钟 离心 6 分钟 4000 转 吸去上清 沉淀 以金标记物干燥基础液重新悬浮 然后用金标记物干燥基础液分别按 1 1 进行稀释 然后 利用喷金仪喷到玻璃纤维上 喷量 1 0 l cm 喷笔口径为 10mm 将喷好的玻璃纤维放置 烘房中 37 2 干燥 24 小时 按正常生产工艺组装试剂条 成品检验方案 组装成的试剂条是否在 15 分钟内检出降钙素原最低检出量参考品 0 1ng ml 成品检验结果 组装成的试剂条能在 15 分钟内检出降钙素原最低检出量参考品 0 1ng ml 结论 该生产工艺生产出来的试剂条符合我们的产品要求 确认为以后采用的生产工 艺 五 质控标准及内部质控品的确立五 质控标准及内部质控品的确立 1 企业标准的制定的缘由 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 8 由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准 我们参考已上市的 人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标 设计了本品的企业内部标准 制定了内部校准品 和质控品 2 2 质控标准质控标准 2 1 准确性标准 取 PCT 零浓度参考品 作为基础样本 将其等体积分为 4 份 在任意 3 份中添加 PCT 纯分析物 使加入浓度分别为 5ng ml 15ng ml 40ng ml 制成 3 份回收样本 分别计算 其回收率 然后计算平均回收率 平均回收率应 95 2 2 最低检测限标准 分别以降钙素原最低检出量参考品 0 1ng ml 和零浓度参考品加样测试 每个浓度参考 品平行测试 20 次 计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD 计算 0 1ng ml 参考品的测试平均 M1 若 M1 M0 2SD 表明最低检测限 0 1ng ml 95 置信区间 最低检测限必须 0 1ng ml 2 3 线性标准 用 50ng ml 的高浓度参考品和 0 1ng ml 的低浓度参考品 混合成 8 个稀释浓度 Xi 每个浓度测定 3 次 分别求出检测结果均值即为实测值 Yi 以稀释浓度 Xi 为自变 量 以检测结果实测值 Yi 为因变量求出线性回归方程 计算线性回归的相关系数 r 及线性相对偏差 要求线性相关系数 r 0 975 线性相对偏差不超过 15 2 4 精密性标准 批内 用同一批次试剂盒分别对企业内部 1ng ml 和 40ng ml PCT 参考品进行检测 各 平行测定 10 次 批内变异系数 CV 15 批间 取三个不同批次的产品 分别测定企业内部 1ng ml 和 40ng ml PCT 参考品 每 个批号重复检测 10 次 批间变异系数 CV 20 3 内部质控品的制备 3 1 最低检出量质控品的制备和验证 3 1 1 降钙素原零浓度质控品的制备和验证 制备方法 10 份经确认 PCT 为阴性 无肉眼可见的溶血 黄疸 乳糜颗粒 HIV 抗体 HBV 抗原 HCV 抗体检测均为阴性的血清标本 进行混合 经