很详细的载体转化计划

PCV 2 PCV 2 衣壳蛋白的原核表达衣壳蛋白的原核表达 实验计划实验计划 1 1 实验目的实验目的 获得较纯的具有反应原性的抗原 建立间接 ELISA 方法 为 PCV 2 单抗杂 交瘤细胞的筛选提供方法 2 2 技术路线技术路线 ORF2 基因片段 质粒载体 酶切 酶切 连接 重组质粒 转 入 感受态大肠杆菌 挑 斑 获得重组质粒的大肠杆菌 IPTG 诱导 纯化 目的蛋白 3 3 实验材料与方法实验材料与方法 3 1 材料 IPTGIPTG 贮存液 贮存液 20 20 w vw v 800mmol L800mmol L 8ml 蒸馏水溶解 2g IPTG 蒸馏水定容至 10ml 0 22um 滤器除菌 分装成 1ml 小份 20 贮存 氨苄青霉素氨苄青霉素 Amp Amp 贮存液贮存液 按 100mg ml 比例将 Amp 粉剂溶于去离子水中 过滤除菌 分装 20 冻存 X galX gal 贮存液贮存液 20mg ml 20mg ml X gal 20mg 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中 20 避光保存 LBLB 液体培养基液体培养基 Tryptone l0g Yeast Extract 5g NaCl l0g 在 1000ml 的容量瓶中 称量上述成分 加入去离子水 950m1 溶解 NaOH 调 pH 值至 7 4 定容至 1000ml 121 高压灭菌 20min LBLB 固体培养基固体培养基 琼脂粉 1 5g 溶于 100m1 液体培养基中 121 高压灭菌 20min 冷却至 50 左右 浇制平板 Amp LBAmp LB 液体培养基液体培养基 于 LB 液体培养基中 加入 Amp 贮存液使终浓度为 100ug ml Amp LBAmp LB 固体培养基固体培养基 琼脂粉 1 5g 溶于 100m1 液体培养基中 121 高压灭菌 20min 冷却 至 50 左右 加入 Amp 至终浓度为 100ug ml 浇制平板 Amp LB X gal IPTGAmp LB X gal IPTG 平板平板 在制备好的 Amp LB 平板上加 40u1 X gal 20mg ml 和 7u1 IPTG 200mg ml 用灭菌 L 型涂布器均匀涂布于平板表面 37 C 温育至完全吸收 BamHIBamHI 酶酶 XhoIXhoI 酶酶 DNADNA 胶回收试剂盒胶回收试剂盒 T4T4 DNADNA 连接酶连接酶 质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒 0 lmol L0 lmol L CaClCaCl2 2溶液溶液 CaCl2 2H2O 1 47g 溶于 100m1 去离子水中 过滤除菌 分装 20 贮存 甘油甘油 30 30 丙烯酰胺丙烯酰胺 w v w v 丙烯酰胺 29g N N 二甲基甲叉双丙烯酰胺 1g 去离子水定容至 100ml pH 不能超过 7 0 过滤 4 于棕色玻璃瓶贮存 1 5mo1 L1 5mo1 L Tris HClTris HCl pH8 8 pH8 8 Tris 碱 18 17g 溶于 80m1 去离水中 加入约 3m1 的浓盐酸 调 pH 8 8 定容至 100m1 lmol Llmol L Tris HClTris HCl pH6 8 pH6 8 Tris 碱 12 1g 溶于 80m1 去离水中 加入约 7m1 的浓盐酸调 pH6 8 定容至 100ml 10 10 过硫酸铵过硫酸铵 过硫酸铵 5g 去离子水定容至 50ml TEMEDTEMED 5X5X Tris Tris 甘氨酸电泳缓冲液贮存液甘氨酸电泳缓冲液贮存液 在 900m1 去离子水中溶解 15 1g Tris 碱和 94g 甘氨酸 然后加入 50ml 10 W N 的电泳级 SDS 贮存液 调 pH 值为 8 3 定容至 1000ml DTTDTT 贮存液贮存液 1mol L 1mol L 20ml 0 01mol L 乙酸钠溶液 pH5 2 溶解 3 09g DTT 0 22um 滤器除 菌 分装成小份 20 C 贮存 2X2X SDSSDS 加样缓冲液加样缓冲液 100mmo1 L Tris HCl pH6 8 200mmol L 二硫苏糖醇 DTT 2 0 SDS 0 03 溴酚蓝 20 甘油 考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液 在 90m1 甲醇 H20 1 1 v v 和 10ml 冰乙酸的混和液中溶解 0 25g 考 马斯亮蓝 R 250 用 Whatman 滤纸过滤 以除去颗粒状物质 脱色液脱色液 甲醇 冰乙酸 水 3 1 6 的体积比配成脱色液 100100 mmol Lmmol L KC1KC1 溶液溶液 0 05M0 05M pH9 6pH9 6 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 NaCO3 1 60g NaHCO3 2 90g 加 950ml ddH2O 溶解 调 pH 至 9 6 定容至 1L 现用现配 可拆卸聚苯乙烯板可拆卸聚苯乙烯板 PCV2PCV2 阴阳性血清阴阳性血清 3 2 方法 3 2 1 引物设计 F 5 TAGGATCCGGATCC T GGA C ATT C TTC AAC AG C C C 3 25nt 其5 带有BamHI位点 R 5 GG CTCGAGCTCGAG TTT AGG GTT AAG TGG G 3 24nt 其5 带有XhoI位点 5 TA CTCGAGCTCGAG GGG G T TT AAG TGG GGG GTC 3 需购 需购 引物 约70元 3 2 2 模板制备 取 0 3g 0 5 立方厘米 病料组织块置于 1 5mL 离心管中 用眼科手术剪组织块剪碎 成粉末状 细糊状 加入 200 L 组织 DNA 提取液 如有结晶应水浴溶解 用研磨棒研磨 再加入 300 L 组织 DNA 提取液 12000rpm 离心 5min 取上清 加入 PEK 蛋白酶 K 20 L 至终浓度 150 g mL 充分混匀 用封口膜将离心管盖 封好 56 消化 2hr 以上或过夜 加入等体积的苯酚 500 L 反复缓慢颠倒离心管 10min 使溶液的两相充分混匀 12 000rpm 离心 10min 用枪将上清液至另一干净离心管 用等体积的苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 重复上述抽提步骤 氯仿 异戊醇 24 1 重复上述抽提步骤 向最后获得的上清液中加入 2 1 0mL 倍体积的无水乙醇淀 DNA 白色的絮状或云雾 状沉淀 挑出的 DNA 沉淀 置于一 0 5mL 离心管中 用 500 L 70 乙醇洗涤两次 加入 50 L 灭菌去离子水溶解 4 或 20 保存待用 已有 已有 组织 DNA 提取所有试剂 3 2 3 PCR 及 PCR 产物纯化 3 2 3 1 PCR 按以下顺序将试剂加入 PCR 管中 共 50ul 去离子水 33 5ul 10 Buffer 5ul MgCl2 25mmol L 5ul dNTPs 10mmol L 1ul F1 25pmol L 1ul R1 25pmol L 1ul DNA 模板 3ul Taq 酶 5U ul 0 5ul 94 3min 94 45s 55 45s 72 1min 30cycles 72 8min 3 2 3 2 PCR 产物纯化 电泳 PCR 产物 切下目的条带 用 DNA 片段回收试剂盒回收 具体按试剂盒说明书操 作 已有 已有 PCR 所有试剂 需购 需购 DNA 胶回收试剂盒 上海生工 SK1131 50 次 270 元 P135 3 2 4 感受态细胞的制备 取 70 冻存的 BL21 菌种 在新鲜的 LB 培养基平板上划线接种 37C 过夜培养 从 LB 平板上挑取单菌落接种 3m1 LB 液体培养基 在 37 恒温振荡器上 225rpm 摇菌 过夜培养 吸取 1ml 上述菌液接种于含 100m1 LB 液体培养基的三角瓶中 于 37 剧烈振荡摇菌 培养 2h 3h 至 OD600 0 4 0 6 将细菌培养物在无菌操作下转移至 50ml 离心管 冰浴 l0min 4 4000rpm 离心 l0min 弃上清 收集沉淀菌体 加入 l0ml 冰预冷的 0 1mol L CaCl2 重悬细胞 冰浴 10min 4 4000rpm 离心 5min 弃上清 收集菌体 10ml 冰预冷 0 1mol L CaC12重悬 冰上放置 30min 4 4000rpm 离心 5min 后 弃上清 在每 50mI 菌液中加入 2m1 冰预冷的 0 1 mol L CaCl2溶液重悬各管细胞 之后加入适 量 50 W V 冰预冷甘油 混匀分装 80 冻存备用 已有 已有 品名备注 BL21 菌株张文波老师惠赠 色谱纯 CaCl2 H2O张文波老师惠赠 Tryptone Yeast Extract 3 2 5 载体的准备 3 2 5 1 质粒的转化 将新鲜制备 或 70 冰箱取出后降至 0 的 的感受态细胞置于冰上 轻弹管壁使 其混匀 吸取 5ul 的质粒加入感受态细胞的离心管中 轻弹管壁 混匀细胞和质粒 然后 冰浴 20min 于 42 水浴热激 90s 后 立即冰浴 2min 加入 900ul 孵育至室温的 LB 液体 培养基 Amp 置于 37 150rpm 振荡培养 50min 吸取 100u1 菌液涂布于 LB Amp X gal IPTG 平板上 37 培养过夜 12h 16h 观察菌落生长情况 挑蓝斑菌落扩大培养 3 2 5 2 质粒的提取 挑取菌落接种 3m1 LB Amp 液体培养基中 37 振荡过夜培养 将 1 5 ml 过夜培养物倒入 1 5m1 离心管中 12000rpm 离心 30s 倾掉上清 吸去培养 液 使细菌沉淀尽量干燥 剩余操作按试剂盒说明书进行 3 2 5 3 质粒的酶切鉴定 对小抽提的质粒用 BamHI XhoI BamHI 和 XhoI 分别做酶切鉴定 建立 20ul 反应体 系 在硅化离心管中依次加入如下试剂 水 12u1 10 Buffer K 2u1 质粒 DNA 4u1 BamHI 1u1 XhoI 1ul 加入各成分后 瞬时离心混匀 37 反应 1h 2h 1 2 琼脂糖电泳检查 能切出目的片 段大小的质粒鉴定为阳性 已有 已有 品名备注 pET 22b 质粒张文波老师惠赠 质粒提取试剂盒 张文波老师惠赠 低熔点琼脂糖张文波老师惠赠 高分子量 DNA MARKER张文波老师惠赠 需购 需购 品名备注 X gal 上海生工 BB0083 100mg 74 元 P116 IPTG 上海生工 IB0168 1g 108 元 P67 玻璃涂棒 上海生工 GS012 5 个 24 元 P268 BamH I 酶上海生工 ER0051 4 000U 187 元 P167 Xho I 酶上海生工 ER0691 2 000U 187 元 P176 3 2 6 PCR 产物 载体的酶切 连接 3 2 6 1 pET 22b 质粒和 PCR 产物的酶切及回收 取 pET 22b 质粒 DNA 及回收的 PCR 产物各 20 u1 分别至 PCR 管中 依次如下成分 总体 积为 50ul 10 buffer K 5 u1 BamHI 2 5 u1 XhoI 2 5 u1 H2O 25 u1 加好各组分后作瞬时离心 在 37 水浴锅中酶切反应 2 个 h 电泳后 分别用 DNA 回 收试剂盒回收酶切产物 3 2 6 2PCR 产物与表达载体的连接 在一个 10u1 体系中 分别加入 BamHI 和 XhoI 酶切回收后的载体 1u1 PCR 产物 3u1 10X 连接 buffer 1ul T4 DNA 连接酶 lul 水 4u1 加好后作瞬时离心混匀 16 连 接过夜 需购 需购 T4 DNA 连接酶 上海生工 EL0014 5U ul 200U 187 元 P181 3 2 7 重组质粒的转化与阳性克隆的筛选 3 2 7 1 重组质粒的转化 取 BL21 感受态细胞置于冰上 轻弹管壁使其混匀 吸取 5ul 的连接物加入感受态细胞 的离心管中 轻弹管壁 混匀细胞和连接物 然后冰浴 20min 于 42 水浴热激 90s 后 立即冰浴 2min 加入 900ul 孵育至室温的 LB 液体培养基 Amp 置于 37C 150rpm 振荡 培养 50min 吸取 100u1 菌液涂布于 LB Amp X gal IPTG 平板上 37 培养过夜 12h 16h 观察菌落生长情况 挑白斑扩大培养 3 2 7 2 质粒 DNA 的提取 具体操作按试剂盒说明书进行 3 2 7 3 重组质粒的酶切鉴定 对提取的质粒用 BamHI XhoI BamHI 和 XhoI 分别做酶切鉴定 建立 20ul 反应体系 在 PCR 管中依次加入如下试剂 水 12u1 10 Buffer K 2u1 质粒 DNA 4u1 BamHI 1u1 XhoI 1ul 加入各成分后 瞬时离心混匀 37 反应 1h 2h 电泳检查 能切出目的片段大小的 重组质粒鉴定为阳性 3 2 7 4 重组质粒 PCR 鉴定 将提取的质粒 作 200 倍稀释后 取 2u1 质粒作模板 PCR 扩增 能扩增出与目的片 段大小相同的质粒即为阳性重组质粒 3 2 7 5 重组质粒测序 测序费用测序费用 约 100 元 3 2 8 SDS PAGE 分析 3 2 8 1 IPDGIPDG 诱导 挑取含阳性重组表达质粒的重组菌的单菌落 接种于 3m1 Amp LB 培养基中 37 活化 过夜后 按 1 接种到 Amp LB 液体培养基中 37 225rpm 振摇培养至对数生长期 OD600 0 6 0 7 加入终浓度为 2mmol L 的 IPTG 于恒温振荡培养器上 37 225rpm 振摇诱导培养 1 6h 3 2 8 2 SDS PAGESDS PAGE I I 分析是否有表达产物及确定最佳诱导时间 分别于诱导前和诱导后不同时间取出 1 0m1 细菌培养物 5 000rpm 离心 10min 收集菌 体 弃上清后加入 2 X SDS 上样缓冲液 煮沸 5min 用 12 的聚丙烯酞胺凝胶进行 SDS PAGE 检查 剩余样品 20 冻存备用 制胶 灌制 12 的分离胶 装好制胶板 加入分离胶 使梳子到胶面的距离约 lcm 胶面上加一层水 室温放置约 30min 待胶充分聚合后吸出水 加入 5 浓缩胶 装上梳子 室温放置约 30min 使胶充分聚合 于 4 放置 2h 后 拔出梳子即可加样进行电泳 加样 取诱导表达菌液 1m1 5000rpm 离心 10min 弃上清 加入 50uL 2 SDS 上样缓 冲液 混匀 煮沸 5min 后 12000rpm 离心 2min 取上清 15ul 上样 同时设蛋白质标 准分子量对照 空载体菌液对照 空载体菌液处理方法同上 加样顺序 1 低分子量蛋白 Marker 2 Bl21 菌体蛋白 3 pET 22b 空质粒诱导前 4 pET 22b 空质粒诱导 3h 5 pET 22b 重组质粒诱导前 6 pET 22b 重组质粒诱导 1h 7 pET 22b 重组质粒诱导 2h 8 pET 22b 重组质粒诱导 3h 9 pET 22b 重组质粒诱导 4h 10 pET 22b 重组质粒诱导 6h 电泳 恒压 200 V 电泳 55min 60min 新鲜配制的甘氨电泳液所需的电泳时间会短些 染色 用至少 5 倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶 在摇床上染色 30min 45min 脱色 将凝胶浸泡脱色液中 脱色 2h 4h 其间换脱色液数次 直到蛋白条带清晰 3 2 8 3 ELISAELISA 抗原性分析 将特殊处理后的蛋白液 超声波 冻融 煮沸 梯度稀释各包被 8 孔 共 16 孔 用已购试剂盒中阴阳性血清 1 4 稀释 酶标二抗 底物等试剂做 ELISA 观察结果 分析该蛋白是否有抗原性 3 2 8 4 SDS PAGESDS PAGE IIII 表达产物水溶性分析 用超声波破裂诱导 3 小时 假设诱导 3 小时时表达产物为峰值 菌体 离心 分别取 上清和沉淀 进行 SDS PAGE 加样顺序 1 低分子量蛋白 Marker 2 BL21 菌体蛋白 3 pET 22b 空质粒诱导 3h 4 pET 22b 诱导前 5 pET 22b 诱导 3h 6 pET 22b 诱导 3h 后裂解上清 7 pET 22b 诱导 3h 后裂解沉淀 根据结果 分析表达产物为水溶性还是以包涵体形式存在 需购 需购 品名备注 蛋白质 MARKER 14 4 97 4KDa 上海生工 BM201 120 元 P198 丙烯酰胺上海生工 AB1032 100g 46 元 P20 甲叉双丙烯酰胺上海生工 P32 甘氨酸上海生工 G0167 100g 28 元 P61 乙酸钠 上海生工 S0602 100g 31 元 P101 考马斯亮蓝 R 250上海生工 C0472 5g 65 元 P320 过硫酸铵过硫酸铵上海生工 A0486 25g 43 元 P26 二硫苏糖醇二硫苏糖醇 DTT DTT 上海生工 DB0058 1g 52 元 P52 TEMEDTEMED 上海生工 T0761 50ml 82 元 P108 3 2 9 蛋白的纯化 InvitrogeneInvitrogene HISHIS 亲和柱纯化亲和柱纯化 如果产物是水溶性蛋白 纯化过程如下 掰掉纯化柱的脚状物 插入小的白色的盖中 直立 用手指弹击管壁 使树脂充分悬浮 放入收集管中 700g 离心 2min 去掉贮液 加 1 ml 样品 让样品浸 泡树脂 30 秒 简单地混一下 然后用力振摇 使树脂充分悬浮 缓慢地摇动 5min 让 带有组氨酸标签的蛋白结合 可在摇床中进行 700g 离 2min 去掉底盖 放入收集管中 再加 lml 样品 重复 2 次 加 lml 洗液 pH8 0 咪唑缓冲液 让洗液浸泡树脂 30 秒 用 手指弹击管壁 充分悬浮树脂 缓缓摇动 5min 去掉底盖 放入收集管中 700g 离 2min 再重复洗一次 再 700g 离 2min 要保证柱床半干 无残留液 如有必要 可以 再离心除去洗液 加 600 1000u1 洗脱液 pH7 0 咪唑缓冲液 去除底盖中的残留液 换 新的收集管 让洗脱液浸泡树脂 1 2min 离心收集洗脱液 然后再加 600u1 洗脱液 充 分悬浮树脂 再洗 1 2 次 用紫外分光光度计测含量 包涵体纯化 变性 复性包涵体纯化 变性 复性 如果产物以包涵体形式存在 接种于含有 Amp 的 LB 培养基 于 37 振荡培养 1 5h 按照 0 1 的比例加入 O 1mM IPTG 诱导 3h 取 200mL 菌液 4C 10000rpm 离心 15min 弃上清 用 PBS 清洗 3 次 用 Buffer A 重悬菌体 加入溶菌酶 lmg mL 磁力搅拌 30 min 后 超声波破碎至清 亮 4 10000 rpm 离心 10 min 弃上清 洗涤包涵体 在沉淀中加入 19 4mL Buffer A 0 3mL 20 Sarkosyl 十二烷基肌氨酸钠 贮存液 剧 烈摇动 使其慢慢溶解 室温静置 1h 10000rpm 离心 lOmin 保留上清 加 20 PEG 8000 210 uL 至终浓度为 0 2 加 50 mM 的氧化型谷胱苷肽 420uL 至终 浓度为 1mM 加 100mM 的还原型谷胱苷肽 420uL 至终浓度为 2 mM 静置 4 复性过夜 以 PBS pH8 0 透析 取出保存备用 需购 需购 品名备注 HIS 亲和柱 Invitrogen P404 谷胱苷肽 氧化型 上海生工 GO524 1g 380 元 P60 谷胱苷肽 还原型 上海生工 G0399 5g 173 元 P60 Sarkosyl 十二烷基肌氨酸钠 溶菌酶上海生工 LB0308 1g 54 元 P71 PEG 8000 上海生工 PB0433 100g 26 元 P84 4 4 可能遇到的困难及解决方法可能遇到的困难及解决方法 4 1 PCR 失败 分析原因 必要时跟换引物 4 2 无表达产物 运用重叠 PCR 突变方法 置换序列中部分稀有密码子 4 3 表达产物无反应原性 重新选择 DNA 区段 5 5 实验时间安排实验时间安排 日期日期实验项目实验项目 7 6 7 11 感受态细胞制备 质粒提取 7 12 DNA 提取 PCR PCR 产物纯化 7 13 PCR 产物 质粒酶切 连接 7 14 7 15 转化感受态大肠杆菌 挑斑 扩大培养 IPTG 诱导 7 16 7 19 SDS PAGE 分析 抗原性分析 7 20 7 22 抗原纯化 6 6 经费预算经费预算 可能需要多次购买可能需要多次购买的 70 210 元 引物 订购一次约 70 元 一定需要一定需要的 867 元 X gal 上海生工 BB0083 100mg 74 元 P116 IPTG 上海生工 IB0168 1g 108 元 P67 玻璃涂棒 上海生工 GS012 5 个 24 元 P268 BamH I 酶 上海生工 ER0051 4 000U 187 元 P167 Xho I 酶 上海生工 ER0691 2 000U 187 元 P176 DNA 胶回收试剂盒 上海生工 SK1131 50 次 270