色谱基础知识及原理ppt课件.ppt

色谱是一种分离工具 而不是传统意义上的分析仪器常见的分离方式 蒸馏 离心 电泳 过滤 超滤等等 色谱是其中一种分离工具 色谱法简介 色谱法 Chromatography 溯源俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理 开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献1906年正式命名 见诸文献 色谱法 Chromatography30年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代 色谱的发明人 俄国科学家 M S Tswett正式命名 色谱 的文献 色谱分离的机理 分离是一个物理的过程 流动相 MobilePhase 固定相 StationaryPhase 样品 溶解于流动相中的溶质 什么是液相色谱 气相色谱 流动相是气相液相色谱 流动相是液相 什么是高效液相色谱 HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法 简称 HPLC是一种区别于经典液相色谱 基于仪器方法的高效能分离手段 高性能的色谱柱 高精度 耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域 医药 环保 石化 生命科学 食品及农业 在技术 理论及应用上仍处于发展阶段 HPLC的仪器配置及流程 溶剂 色谱泵 自动进样器 HPLC色谱柱 检测器 废液 数据处理系统 HPLC的仪器配置及流程 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器 数据处理系统 溶剂 色谱图 HPLC图形结果 Chromatogram 色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图 其纵坐标为信号强度 横坐标为保留时间 色谱峰 保留时间 分 基线 峰高 峰宽 响应值 液相色谱图相关术语 色谱峰 Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底 PeakBase峰的起点与终点之间连接的直线峰高 PeakHeight峰最大值到峰底的距离峰宽 PeakWidth在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半 高 峰宽 PeakWidthatHalfHeight通过峰高的中点作平行于峰底的直线 其与峰两侧相交两点之间的距离 液相色谱图相关术语 峰面积 PeakArea峰与峰底之间的面积 又称响应值标准偏差 StandardError0 607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰 TailingPeak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰 LeadingPeak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰 GhostPeak并非由试样所产生的峰 亦称假峰 液相色谱图相关术语 基线 Baseline在正常操作条件下 仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移 BaselineDrift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声 N BaselineNoise由各种因素所引起的基线波动谱带扩展 BandBroadening由于纵向扩散 传质阻力等因素的影响 使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象 液相色谱图相关术语 死时间 t0 Deadtime不被固定相滞留的组分 从进样到出现峰最大值所需的时间保留时间 tR Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积 V0 Deadvolume不被固定相滞留的组分 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积 VR Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 液相色谱应用 制备型液相色谱 分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用对分离及纯化的要求化合物的稳定性样品的复杂性制备量的要求纯度的要求 及纯度的鉴定方法的安全性 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速 液相色谱应用 分析型液相色谱 定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域定性分析 不是色谱的强项基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外 质谱或其他检测器对定量及定性分析的要求灵敏度 精度及准确度的要求样品量的要求 复杂样品的分析能力容易使用 液相色谱原理 基本概念及方法开发 液相色谱实验所需的基本参数流动相 种类及配比 等度或梯度固定相 色谱柱类型及内径 长短流动相输送系统参数 流速检测器参数 紫外检测波长 灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法 亦称色谱条件 评价液相色谱方法的标准 问题 什么样的分离结果是好的 分离度 什么是色谱的分离度 分离度的公式 R 分离程度的量度 影响分离度的因素 K 及N 分离度方程 K 是容量因子 表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是分离因子 描述两个被分离组份分离的好坏程度 是化学因素N是理论塔板数 描述色谱峰谱带展宽的程度 若N增加2倍或3倍 R会如何变化 分离度方程解析 柱效项 N 理论塔板数 分离效率的量度 PW 5 PW 2 色谱柱的柱效N 理论塔板数计算公式 Ws方法Wtan16切线法Wh5 54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s 峰宽与塔板数的关系 理论塔板数 峰宽 L k 2 Vo 1000 L 塔板数与流速的关系 流速 cm min 塔板数 103 分离度与N的关系 分离度方程解析 分离因子项 若 1 1or1 4 R会如何变化 分离因子 峰分离程度的量度 分离因子 定义 a 1时两组分分不开 改变a的途径改变固定相或改变流动相改变温度改变样品的本身性质 通过改变流动相改变 同样强度的不同溶剂改变色谱柱 改变分离因子 的例子 若 1 2 10or20 R会如何变化 分离度方程解析 容量因子项 K 容量因子 保留能力的量度 V0 V1 V2 V3 时间0 5125 k 值k 项k 对分离度影响00011 2 5022 3 6733 4 751010 11 912020 21 95 容量因子k 与分离度的关系 与R的关系 容量因子k 与峰高的关系 改变k 值的方法 调节流动相的极性 pH 离子强度等梯度淋洗 改变容量因子K 的例子 谱图 k 及N如何控制分离度 液相色谱原理 更进一步的探讨 离子型化合物的分离方式多数化合物是离子型的 使用离子交换柱 离子交换法主要用于 强 阴 阳离子使用反相柱离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值 使样品成中性离子对色谱法 加入 对离子 使样品呈中性 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值 抑制样品离子的电离主要适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值 使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2 8 较保险值3 7 内 离子抑制色谱实例 而在乙腈 水并且pH 7时 多数组份保留时间很短 无法完全分离 离子抑制色谱的使用范围 下列情况下不能使用离子抑制方法 如果 一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱 在pH高于7时用离子抑制法使用 离子对色谱法 在高pH值下用离子抑制 色谱柱 D18 613 聚合物基质 室温流动相 乙腈 0 01MNH4OH 0 01MTBA流速 1 0ml min检测 UV 240nm样品 巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入 离子对 试剂与样品中可电离的组份形成 对离子 在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型 磷酸季丁铵 PICA 适用于弱酸烷基磺酸盐 PICB 适用于弱碱烷基长度不同 形成对离子的能力不同通常有 B5 B6 B7 B8 后面的数字是碳链的长度磷酸二丁胺 PICD4 适用于弱碱 离子对色谱机理 使用五烷基磺酸盐 Packing BondapakC18Column 4mmIDx30cmSolvent Methanol H2Owith0 005MPENTANESulfonicAcid 1 HOAc 50 50 FlowRate 2 0ml minDetector UV 254nm 0 1AUFS 1 MaleicAcid2 Phenylephrine HCl3 Phenylpropanolamine HCl4 Naphazoline HCl5 Phenacetin6 PyrilamineMaleate 使用六烷基磺酸盐 Packing BondapakC18Column 4mmIDx30cmSolvent Methanol Waterwith0 005MHEXANESulfonicAcid 1 HOAc 50 50 FlowRate 2 0ml minDetector UV 254nm 0 1AUFS 1 MaleicAcid2 Phenylephrine HCl3 Phenylpropanolamine HCl4 Naphazoline HCl5 Phenacetin6 PyrilamineMaleate 用离子对 还是用离子抑制方法 开发液相色谱方法的考虑因素 分离度是色谱分离中主要考虑的因素除分离度之外 在开发色谱方法时 以下几个因素也都要考虑 灵敏度载样量分析速度溶剂损耗 成本容易使用色谱柱寿命效率 基本的HPLC系统 色谱泵及液相色谱对泵的要求 稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成有效的流速范围制备色谱或微柱 窄柱色谱更为关注滞后体积仅仅应用于梯度实验目的 在任何情况下保持最高精度 梯度 高压混合 高压梯度使用多台色谱泵 在泵后混合配置灵活 简单 脱气简单易调节梯度的滞后体积 梯度 低压混合 低压梯度用单泵产生梯度 泵前 低压端 混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当 梯度的准确性受影响滞后体积 系统体积 设计合理 梯度滞后 系统体积的影响 注意 滞后体积包括进样器 阻尼器 混合器及其管路 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如 滞后体积为2 0ml 流速1 0ml min实际梯度会比设置值晚2分钟响应 没有问题对微柱色谱影响更大 同上例但流速0 1ml min实际梯度会比设置值晚20分钟响应 不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为2 4ml 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统 滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果 梯度的准确性不好 造成 方法的适应性不好用静态梯度混合器 固定滞后体积可明显改善梯度特性 色谱柱反压变化对梯度实验的影响 P680ALPGwithoutpulsedamperBack pressure 60bar 85barand105barVariation 1 PumpwithpulsedamperBack pressure 60bar 85barand105barVariation 2 Acclaim120 C18 5 m 4 6x100mm 0 5mL min 25 C 5 Linjectionvolume UVdetectionat256nm Eluent A Waterand B Acetonitril Gradient 30 bto100 Bin10min Methyl Ethyl Propyl andButylparabene 10mg Leach 液相色谱的检测器 常规检测器示差折光检测器 RefractiveIndex 紫外 可见光吸收检测器 UV Vis 荧光检测器 Fluorescence 蒸发光散射检测器 EvaporativeLightScattering 其他检测器 OtherDetectors 高端检测器光电二极管矩阵检测器 PhotodiodeArray 质谱检测器 MassSpectrometry HPLC检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系 并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的受HPLC系统其他部件的影响 检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距 用于HPLC的检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离 HPLC检测器可以分为 溶质性质检测器 Solutepropertydetectors 对溶质的物理或化学性质响应 一般不反应流动相的变化 选择型 整体性质检测器 Bulkpropertydetectors 不管是否有溶质 对流动相任何物理性质的变化作出响应 通用型 不同种类的检测器的分类 理想的HPLC检测器 高灵敏度 可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力 温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性 灵敏度 信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值 即峰高与基线噪音的比值 S N 检测限 LOD S N 3定量限 LOQ S N 10好的信噪比有利于 更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度 均一性 6 1 N S 方法开发的过程 Adaptedfrom Snyder L R Kirkland J J Glajch J L PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd Wiley Interscience NewYork 1997 p 2 选择液相色谱的检测器 要考虑的因素 你要分离的化合物 样品的化学特性化学结构 分子量及紫外光谱等等流动相的影响 溶剂 缓冲盐改性剂等 梯度还是等度灵敏度需求是否有双检测的需求 选择液相色谱的检测器 通用检测器RIELSDMS灵敏度mgngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是 选择性检测器ABSFLECCondMS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是 可供选择的液相色谱检测器 Absorbance UV Vis ChemiluminescenceCircularDichroism Chiral ConductivityElectrochemicalEvaporativeLightScatteringFluorescenceLaserInducedFlorescenceLaserInterferometerLaserPolarimeterMassSpectrometric LC MS NitrogenSpecificDetectorNuclearMagneticResonanceOfflineMethodsOpticalRotationDetectorPhotoDiodeArrayRefractiveIndexRadiochemicalSulfurSpecificDetectorViscometryMultiAngleLightScattering 示差折光 RefractiveIndex 检测 示差折光检测器 RI 是第一个商品化的液相色谱检测器 上世纪六十年代末 七十年代初 通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值 示差检测器 基本原理 检测基于被分析物的折光指数的差异测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别 DifferentialRI 典型的应用领域没有紫外吸收 荧光的化合物 例如 碳水化合物 Carbohydrates 聚合物 Polymers 脂肪酸 FattyAcids 及油脂类 Lipids 示差检测器的优 缺点 优点通用检测器容易使用 通常来说是比较耐用的检测器维护成本低缺点灵敏度低 选择性差对流速 温度及粘度的变化敏感不能用于梯度方法色谱峰可能是正的 也可能是负的 示差检测器的优点 通用性 根据随机统计 任何一对液体都会有大约0 07的折光率差异因此 除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同 都会被检测到 示差检测器的缺点 灵敏度 缺乏灵敏度 和其他检测器相比 RI检测器一般灵敏度较低 流动相 MeOH H2O60 40流速 1 0mL min色谱柱 C18色谱柱温 30 C检测温度 35 C样品 ParabenMixture 示差检测器的缺点 不适宜作梯度 流动相 A CH3CN H2O75 25B CH3CN流速 1 4mL min色谱柱 NH2色谱柱温 30 C检测温度 35 C ChromatographyForum IsRIwithaReversePhasegradientpossible ByXXXXXXXXX Ihaveagoodseparationofamulti substituted cyclohexanethatfullyresolves 12differentoligomers IcandetectthecomponentsbyMS butIwouldliketouseastandardLCdetectorinstead Thereisvirtuallynoadsorptionabove230nmandbelow230nmpicksupsolventinterference I mconsideringusingRIdetectionandafterwardsubtractingablankrun IsthereanyhopeofthisworkingorwouldIbewastingmytime 示差检测器的缺点 对温度敏感 流动相 甲醇 0 25mL minute检测器温度 35 C 没有使用柱温箱 吸光度 AbsorbanceUV Vis 检测 目前实验室中最流行的选择多数公司约75 的检测器是吸光度检测器 其中50 是多波长 25 是PDA 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大 吸光度检测器 UV Vis 优点 这种检测器简单 可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以 吸光度检测器 UV Vis 缺点 由于不是所有化合物都有吸光度 因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时 需要使用多波长检测 或使用折衷的波长受流动相组成的影响 用截止波长以上至少5 10nm作为工作波长缓冲盐 离子对试剂 胺改性剂也会有影响 背景吸收的影响 背景吸收降低了线性范围多数流动相有紫外吸收 背景吸收对紫外检测器噪音的影响 UVSpectrumofEluentswith0 1 TFAAgainstHPLCGradeH2OBlank 溶剂混合的基线噪音 色谱条件色谱柱 C18 5 m 3 9x150mmat35 C 流动相 A 0 1 TFAinWater B 0 1 TFAinAcetonitrile 梯度 5 40 Bin35min 流速 1 0mL min 样品 水 10 Linj vol 检测 214nm 为何如此重要 五个小肽的5ng进样 好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰 在不好的色谱系统中 第一个峰则消失在基线噪音中 基线噪音对积分的影响 荧光 Fluorescence 检测 发荧光的化合物吸收光 UV或VIS 其分子达到激发态 其返回到基态时发射光的现象即荧光 基态 激发态 S1 S0 激发 1 振动能 2 发射 3 1 分子在吸收UV或可见光后进入激发态 分子达到不稳定的高能量状态 2 电子失去过剩的能量成为振动能 并达到最低的激发单重态 3 电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象 荧光检测器原理 荧光检测器的应用 环境中的污染物多环芳烃 PAH 多酚 氨基甲酸酯等食品 饮料食品中的毒素 例如 黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药 氨基甲酸酯类杀虫剂 黄曲霉毒素 多环芳烃 PAH 维生素 荧光检测器的优点 选择性提高灵敏度提高 在pg fg范围 低背景技术 MDA及MDMA柱上200pgExcitation 280Emission 360 荧光检测器的缺点 不是所有化合物都有荧光 需要衍生检测器对溶解气体及其他淬灭物质 如甲醇 敏感对Ex及Em的最佳 易受温度 溶剂的极性和粘度 溶剂的pH值及样品浓度影响多数仪器的批次间差异较大 同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果 有的仪器信号及噪音大于另一台2 3倍 光电倍增管的特征是导致这个现象的原因 溶剂中溶解的气体对响应值的影响 浓度对芘 Pyrene 最大激发波长的影响 From Turro N J ModernMolecularPhotochemistryMenloParkCA Benjamin CummingsPublishing 1978 蒸发光散射 EvaporativeLightScattering 用氮气把流动相吹成细雾状流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉蒸发的溶剂被从检测器中除去溶质的挥发性小于流动相 因此产生颗粒束与光束相交被颗粒散射的光由光电倍增管 PMT 收集PMT的输出与溶质的存在量呈比例关系 蒸发光散射检测器原理 EvaporativeLightScattering简称 ELSD ELSD 优点及应用领域 通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测可以作梯度实验 检测下限可到纳克级水平对环境条件不敏感 可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相应用领域 碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制药行业表面活性剂天然产物 ELSD 缺点 不能使用不挥发性的流动相 例如 磷酸盐 要求使用雾化气源 典型的是氮气 不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化破坏性技术蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里对挥发性化合物的检测不理想一般得到的是非线性校正曲线某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器 光电二极管矩阵 PhotoDiodeArray PhotoDiodeArray简称 PDA或DAD PDA检测器 特点 三维水平的吸光度检测器 二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的在整个UV Vis带宽上检测吸光度都需要相应的软件进行数据的分析 PDA检测器的用途及要求 光电二极管检测器可以提供许多又用的功能光谱信息色谱峰纯度谱库拟合像其他所有的UV Vis检测器一样 需要 高的信噪比 好的线性另外 还需要 光学分辨率光谱灵敏度及光谱分析软件 光学分辨率 带宽 好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息 分辨率与色谱性能 高分辨率给出更多数据点 同样波长范围 高分辨率有更好的线性低分辨率的数据文件尺寸较小宽的光学带宽可以得到更高的光通量 灵敏度 1 2nm 14 4nm PDA的优点及缺点 优点通用的UV Vis检测好的选择性 线性提供色谱峰的UV Vis光谱图 峰确认 可提供纯度估计缺点低光学通量 较窄的带宽通量 与普通UV Vis相比更复杂 容易漂移灯输出能量随时间降低 质谱 MassSpec 作为HPLC检测器 MS 质谱 MassSpectrometry 是一种按照分子量及其电荷分离物质的技术 经过多年的不断开发及改进 已经使质谱成为一种多功能 高灵敏度 并被愈来愈广泛使用的分析技术 LC MS 液相色谱与质谱的连用 需要 除去HPLC的溶剂 产生离子 分离离子 检测离子 计算离子强度 处理数据 除去溶剂 离子化前的准备 雾化 Nebulization 蒸发溶剂或解吸附 Evaporation orDesorption 大气压下或减压下 AtmosphereorPressurereduction 离子化 Ionization IonSource LC MS的离子产生 电子轰击源 ElectronImpact ElectronIonization EI 大气压电离源 AtmosphericPressureIonization A