cd59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

1 / 8CD59 基因突变在肿瘤逃逸中的作用【摘要】目的 构建 CD59 突变的重组体，研究 Hela细胞中 CD59 基因突变引起肿瘤凋亡相关分子 caspase?3 表达的变化。方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59 的第 3941 位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTER?MAX 质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela 细胞。G418 筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变 CD59 的细胞株，用免疫组化法检测转染前后 Hela 细胞内 caspase?3 表达的变化。结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了 CD59 氨基酸突变的重组质粒。转染突变 CD59 后 Hela 细胞内caspase?3 表达明显减少，与转染正常 CD59 的 Hela 细胞比较差异有显著意义锚着于多种细胞膜表面4，通过阻止补体攻膜复合物(MAC)的装配保护宿主细胞免受补体介导的溶细胞作用5,6。近年来的研究显示，CD59 与肿瘤的生长失控和转移密切相关2,3，但有关其与肿瘤逃逸的相关性研究目前尚未有定论。通过研究 caspase?3 的表达变化，探讨 CD59 与肿瘤逃逸的相关活性位点，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。 1 材料和方法 2 / 8材料 pALTER?MAX、pALTER?CD59 由美国哈佛大学惠赠, EcoR 酶、DNA 聚合酶、T4 连接酶均购自大连 TaKaRa 公司，细菌菌株为本室保存，小牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品，Trypsin 购自 Sino?American Biotec 公司，RPMI 1640 培养基、G418 选择抗生素、LipofectamineTM2000 均为 Invitrogen 公司产品，鼠抗人CD59 单抗为本实验室制备，羊抗鼠 IgG2a?FITC、羊抗人CD59 单抗和 HRP 标记兔抗山羊 IgG 均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体 CD59?FITC 购自 COULTER 公司，caspase?3 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela 细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7，T3；突变引物：M/F，M/R。以上引物均购自上海生物工程有限公司。 方法 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒3 / 8pALTER?CD59 的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物 pT7：5?TAATACGACTCACTATAGGC?3；通用引物T3：5?TATTCAGGCGTAGCAACCAG?3 ；突变引物M/F：5?GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCAT?TGC?3； 突变引物M/R：5?ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG?3。 以已构建的 CD59 cDNA 重组质粒为模板，以常规引物 pT7 和诱变引物 M/R 进行 PCR1 反应，以已构建 CD59 cDNA 重组质粒为模板，以常规引物 T3 和诱变引物 M/F 行 PCR2 反应，将纯化 PCR1 和 PCR2 产物等量混合为模板，以通用引物 pT7和 T3 行 PCR 扩增反应，从而得到所需的诱变位点的大量DNA 片段，该突变可使 CD59 第 3941 位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物，并回收目的条带。将质粒 pALTER 及含有全长突变 CD59 基因的 PCR 产物用EcoR 单酶切后，经 T4 DNA 连接酶作用，使突变基因插入到 pALTER 质粒的 EcoR 位点, 以构建重组真核表达质粒。用 TSS 法使重组质粒转化感受态的细菌 JM109，经氨苄青霉素筛选后，挑取单个菌落用酚抽提法提取质粒，以EcoR 酶切鉴定。对筛选的克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。 4 / 8Hela 细胞的转染及阳性克隆的筛选 重组质粒的转染参照 LipofectamineTM2000 的说明书进行。转染后 24 h，将细胞按 110 稀释传代，24 h 后加入含有 800 g/L G418 的选择性培养基，筛选 2 周后套取单克隆并继续筛选2 周，扩大培养始终维持 G418 在 400 g/L。连续传代 10 次后，收集细胞进行鉴定。 Hela 细胞中突变 CD59 的检测 免疫荧光技术: 刮取细胞, 离心去上清, 用 PBS 洗 3 次。涂片、干燥后, 用乙醇固定后晾干, 加入鼠抗人 CD59 单克隆抗体，37 孵育 30 min, 洗涤后加入羊抗鼠的 FITC?IgG 二抗，于 37 孵育 30 min，洗涤，干燥后在荧光显微镜下观察结果。ELISA 法：收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质质量浓度为 5 mg/L,用包被液以 11、12、14 稀释待测标本和空白 PALTER 对照,并分别设 6 个复孔,每孔加入100 L 样品,4 包被 18 h,封闭,加入鼠抗人 CD59 抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG,然后加底物显色液显色,测定 495 nm 处吸光度值。流式细胞术：刮取转染突变 CD59 的细胞株(5108/L)，加入 FITC?抗人 CD59 单克隆抗体，设置野生 Hela 细胞为对照，实验组及对照组均设定 FITC?IgG 二抗，同型对照，上机检测。 5 / 8肿瘤逃逸相关分子 caspase?3 的检测 用免疫组织化学法检测转染突变 CD59 后 Hela 细胞内 caspase?3 表达的变化，操作按照 caspase?3 免疫组化试剂盒使用说明书进行。用 Imagepro?plus 软件对所得图片进行吸光度测量。统计学处理 数据间比较采用 t 检验。 2 结果 重组质粒的鉴定 以 EcoR 酶对重组质粒进行酶切,获得 1 条 496 bp的电泳带,与所插入的片段的大小相一致(图 1)。测序结果表明,突变 CD59?pALTER 含有突变 CD59 的全长 cDNA 序列。见表 1。 荧光免疫组化检测 6 / 8荧光显微镜下可见转染突变 CD59 的 Hela 细胞表面的荧光亮度明显强于未转染突变 CD59 的 Hela 细胞。 ELISA 检测 转染突变 CD59 的 Hela 细胞裂解产物的 CD59 蛋白表达量明显高于 Hela 对照组，差异有显著性。见表 2。 流式细胞术检测 转染突变 CD59 的 Hela 细胞的 CD59 表达率为%。 转染前后 Hela 细胞内 caspase?3 的表达变化 转染突变 CD59 后 Hela 细胞的平均吸光度值为，转染正常 CD59 的 Hela 细胞的平均吸光度值为,两者比较，差异有显著性。 7 / 83 讨论 CD59 是一种 GPI 蛋白，可以作用于补体激活终末阶段的 MAC 的形成，使肿瘤细胞免受补体介导的溶细胞作用从而引起肿瘤逃逸。目前已有研究显示,CD59 分子中N37H44 位基因突变可导致糖尿病的发生,其 NMR 结构显示抗补体活性区域也主要集中于 N37H44 之间7。肿瘤逃逸相关活性位点虽然尚未有明确定位,但无疑为寻找该活性位点提供了理论性的指导，从而引导我们发现肿瘤逃逸中可能存在的其他途径。 表 1 突变人 CD59 与野生型人 CD59 的差别 表 2 ELISA 实验结果 与野生 Hela 细胞比较，*t=,P 6MIYAGAWA S, SHIRAKURA R, MATSUMIGA G, et al. Possible of prevention of hyper acute rejection by DAF and CD59 in xenotransplantation J. Transplant Proc, 1994,26(3):1235?1238. 8 / 87高美华,王秋波,张艳丽,等. 人突变 CD59 基因表达蛋白功能的研究J. 青岛大学医学院学报, XX,41(3):220?223. 8LEVINE A J, MOMAND, FINALY C A. The p53 tumor suppressor geneJ. Nature, 1991,351(6326):453?456. 9