蛋白酶活力的测定

精品文档 1欢迎下载 实验三实验三 蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定 一 目的一 目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术 二 原理二 原理 蛋白酶水解酪蛋白 其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林 酚试剂还原 生成鉬蓝 与钨蓝 以比色法测定 三 试剂及仪器试剂及仪器 1 福林 酚试剂 称取 50g 钨酸钠 Na2WO4 2H2O 12 5g 钼酸钠 Na2MoO4 2H2O 置入 1000mL 原底烧瓶中 加 350mL 水 25mL85 磷酸 50mL 浓盐酸 文火微沸回流 10h 取下回流冷凝器 加 50g 硫 酸锂 Li2SO4 和 25mL 水 混匀后 加溴水脱色 直至溶液呈金黄色 再微沸 15min 驱除 残余的溴 冷却 用 4 号耐酸玻璃过滤器抽滤 滤液用水稀释至 500mL 使用时用 2 倍体积的水稀释 2 0 4mol L 碳酸钠溶液 称取 42 4g 碳酸钠 用水溶解并定容至 1000mL 3 0 4mol L 三氯乙酸溶液 称取 65 5g 三氯乙酸 用水溶解并定容至 1000mL 4 2 酪蛋白溶液 称取 2 00g 酪蛋白 又名干酪素 加约 40mL 水和 2 3 滴浓氨水 于沸水浴中加热溶解 冷却后 用 pH7 2 磷酸缓冲溶液稀释定容至 100mL 贮存于冰箱中 5 pH7 2 磷酸缓冲液 0 2mol L 磷酸二氢钠溶液 称取 31 2g 磷酸二氢钠 NaH2PO4 2H2O 用水溶解稀释至 1000mL 0 2mol L 磷酸氢二钠溶液 称取 71 6g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H2O 用水溶解稀释至 1000mL pH7 2 磷酸缓冲溶液 取 28mL 0 2mol L 磷酸二氢钠溶液和 72mL 0 2mol L 磷酸氢二 钠溶液 用水稀释至 1000mL 6 标准酪氨酸溶液 准确称取 0 1g DL 酪氨酸 加少量 0 2mol L 盐酸溶液 取 1 7mL 浓盐酸 用水稀释至 100mL 加热溶解 用水定容至 1000mL 每毫升含 DL 酪氨酸 100 微克 7 仪器 分光光度计 试管 四 操作步骤操作步骤 1 标准曲线绘制 取 9 支试管 按下表将标准酪氨酸溶液稀释 编 号 012345678 标准酪氨酸溶液 mL 100 g mL 012345678 水 mL 1098765432 稀释酪氨酸溶液浓度 g mL 01020304050607080 在上述各管中各取 1mL 分别加入 5mL 0 4mol L 碳酸钠溶液 1mL 福林 酚试剂 于 400C 水浴显色 20min 在 680nm 波长下测吸光度 绘制标准曲线 在标准曲线上求得吸光 度为 1 时相当的酪氨酸 g 数 即为 K 值 精品文档 2欢迎下载 2 酶液的制备 准确称取酶粉 0 5g 用 pH7 2 磷酸缓冲溶液定容至 100mL 置入 400C 水浴浸取 0 5h 用纱布过滤 根据酶活力的高低 再用 pH7 2 磷酸缓冲溶液稀释一定倍数 使其测定 的吸光度在 0 2 0 4 范围内为宜 约 4 5 倍 3 测定 取一支离心管 加入 1mL 稀释酶液 置入 400C 水浴中预热 3 5min 再加入预热至 400C 的 2 酪蛋白溶液 1mL 准确及时保温 10min 立即加入 2mL0 4mol L 三氯乙酸溶液 15min 后离心分离或用滤纸过滤 吸取 1mL 清液 加 5mL0 4mol L 碳酸钠溶液 最后加入 1mL 福林 酚试剂 摇匀 于 400C 水浴中显色 20min 另取一支离心管为空白管 在空白管中先加入 1mL 稀释酶液 再加入 2mL0 4mol L 三 氯乙酸溶液 再加 1mL2 酪蛋白溶液 15min 后离心分离或用滤纸过滤 吸取 1mL 清液 加 5mL 0 4mol L 碳酸钠溶液 最后加入 1mL 福林 酚试剂 摇匀 于 400C 水浴中显色 20min 以空白为对照 在 680nm 波长下测吸光度 4 计算 蛋白酶活力单位的定义 1g 酶粉 在 400C pH7 2 下 每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的 微克 g 数 蛋白酶活力 W NEK 1 10 4 式中 E 试管的吸光度 4 离心管中反应液的总体积 mL 10 反应 10min N 稀释倍数 W 酶粉称取量 g K 为 Y 1 时 X 的值 即 1 14 结果与分析 结果与分析 OD680CK 1 2 3 0 3 85 2 05 3 71 表面上看 2 号样的数据看似很有可以于是从上面的表格分析 平均的习惯值为 样品标准误差为3 20 3 3 712 053 85 1 00 1 3 3 20 3 713 20 2 053 20 3 85 222 根据格拉布斯法则来判断样品 2 数据是否舍去 1 1 sxp n x Xp 质疑的数据 平均值x 为置信水平 N 为样品数 精品文档 3欢迎下载 S 为样品标准误差 所以样品 2 的数据属于正15 120 3 05 2 15 1 1 1531 00153 1 s 3 05 0 常范围内 即在处理数据的时候不应该将样品 2 忽略舍去 于是样品的酶的活力 样品 1 酶活力为702 24 5 0 1 200 10 4 3 851 14 样品 2 酶活力为373 92 5 0 1 200 10 4 2 051 14 样品 3 酶活力为676 704 5 0 1 200 10 4 3 711 14 平均酶活力为 584 288 3 676 704373 92702 24 从上述的实验 样品 2 的波动的原因可以归结为一 有可能是在酶液移液的时候有过多的 损失而造成了酶活力很少的偏差 二 有可能是在处理酶液的时候由于条件的不适而造 成酶活力的降低 有可能实验时候温度的波动 三 有可能是分光