现代分子生物学笔记(基础理论部分)汇总

第二章 染色体与 DNA 第一节 染色体 1 真核细胞的染色体具有如下性质 分子结构相对稳定 能够自我复制 使亲子代保持连 续性 能指导蛋白质的合成 从而控制生命过程 能产生可遗传的变异 2 染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白 组蛋白是染色体的结构蛋白 它与 DNA 组 成核小体 组蛋白分为 H1 H2A H2B H3 H4 组蛋白 histones 真和生物体细胞染色质中的碱性蛋白质含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特 别多 二者加起来约为所有氨基酸残基的四分之一 3 组蛋白的一般特性 进化上的极端保守 不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的 特别是 H3 H4 1 可能对稳定真核生物的染色体结构起重要作用 无组织特异性 2 肽链上氨基酸分布的不对称性 3 存在较普遍的修饰作用 4 富含赖氨酸的组蛋白 H5 5 4 非组蛋白 主要包括与复制和转录有关的酶类 与细胞分裂有关的蛋白等 5 真核生物基因组 DNA 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列 而且功能 DNA 序列大多被不编码 蛋白质的非功能 DNA 所隔开 人们把一种生物单倍体基因组 DNA 的总值称为 C 值 在真 核生物中 C 值一般是随生物进化而增加的 高等生物的 C 值一般大于低等生物 但某些两 栖类的 C 值甚至比哺乳类还大 这就是著名的 C 值反常现象 6 真核细胞 DNA 序列可分为三类 不重复序列 在单倍体基因组里 一般只有一个或几个拷贝 占 DNA 总量的 1 40 80 结构基因基本上属于不重复序列 中度重复序列 重复次数在 10 104 之间 占 DNA 总量的 10 40 各种 rRNA tRNA 2 以及某些结构基因 如组蛋白基因 都属于此类 高度重复序列 如卫星 DNA 只在真核生物中出现占基因组的 10 60 由 10 60 个碱 3 基组成 在 DNA 链上串联重复高达数百万次 这类 DNA 高度浓缩 是异染色质的组成部 分 可能与染色体的稳定性有关 7 染色质与核小体 染色质纤维细丝是由 DNA 和组蛋白构成 DNA 和组蛋白构成核小 体 核小体连成念珠状构成染色质 核小体的装配过程 1 两分子的 H3 和两分子的 H4 先形成四聚体 然后由 H2A 和 H2B 构成的异二聚体在该四聚 体的两侧分别结合而形成八聚体 长 146bp 的 DNA 按左手螺旋盘绕在八聚体上 1 8 圈 形 成核小体的核心颗粒 每圈约 80bp 核心颗粒两端的 DNA 各有 11bp 与 H1 结合 形成完 整的核小体 核小体的形成是染色体压缩的第一个阶段 染色体的压缩 2 DNA 双链以左手螺旋盘绕在组蛋白形成的八聚体核心上即核小体 念珠状结构 核小 体结构进一步盘绕折叠形成染色质丝 组成突环 玫瑰花结 螺线圈 由螺线圈组成 染色单体 8 真核生物基因组的特点 真核基因组庞大 一般都远大于原核生物的基因组 1 真核基因组存在大量的重复序列 2 真核基因组的大部分为非编码序列 占整个基因组序列的 90 以上 该特点是真核生物 3 与细菌和病毒之间最主要的区别 真核基因组的转录产物为单顺反子 4 真核基因是断裂基因 有内含子结构 5 真核基因组存在大量的顺式作用元件 包括启动子 增强子 沉默子等 6 真核基因组中存在大量的 DNA 多态性 单核苷酸多态性和串联重复序列多态性 7 真核基因组具有端粒结构 8 单顺反子 真核基因转录产物为单顺反子 即一条 mRNA 模板只含有一个翻译起始点和终 止点 因而一个基因编码一条多肽链或 RNA 多顺反子 在原核生物中 通常是几种不同的 mRNA 连在一起 相互之间由一条短的不编 码蛋白质的间隔序列所隔开 这种 mRNA 叫做多顺反子 mRNA 这样的一条 mRNA 链含 有指导合成几种蛋白质的遗传信息 9 原核生物基因组 原核生物基因组很小 大多只有一条染色体 只有很少基因是以拷贝形式存在 且 DNA 含量很少 10 原核生物基因组特点 结构简练 原核 DNA 分子的绝大部分是用来编码蛋白质的只有很少的一部分不转录 1 存在转录单元 原核生物 DNA 序列中功能相关的 RNA 和蛋白质基因 往往丛集在基因 2 组的一个或几个特定部位 形成功能单元或转录单元 它们可被一起转录为含多个 mRNA 的分子 称为多顺反子 mRNA 有重叠基因 同一段 DNA 携带两种或两种以上不同蛋白质的编码基因 3 第二节 DNA 的结构 1 DNA 的一级结构 指 DNA 分子中核苷酸的排列顺序 DNA 一级结构特征 DNA 分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸链盘绕而成 DNA 分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接 排在外侧 构成基本骨架 碱基排在内侧 两条链上的碱基互补配对 2 DNA 的二级结构 指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构 通常情况下 分为两大类 右手螺旋 A DNA B DNA 和左手螺旋 Z DNA DNA 双螺旋结构 两条 DNA 链之间形成氢键 双螺旋内部形成的疏水区 消除了介质中 水分子对碱基之间氢键的影响 介质中的阳离子中和了磷酸基团的负电荷 降低了 DNA 链之间的排斥力 范德华力 Z DNA 指左手螺旋 DNA 3 DNA 的高级结构 指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构 负超螺旋 拓扑异构酶或溴乙啶 松弛 DNA 拓扑异构酶或溴乙啶 正超螺旋 第三节 DNA 的复制 1 半保留复制 DNA 在复制过程中 碱基间的氢键首先断裂 双螺旋被分开 每条分子 分别做模版合成新链 产生互补的两条链 每个子代 DNA 分子的一条链来自亲代 DNA 另一条是新合成的 2 半不连续复制 DNA 在复制时 在一个复制叉上同时进行两个方向的 DNA 复制 一 条链的合成是连续的 另一条是不连续的先合成一系列的 5 3 的短片段 然后在 DNA 连 接酶作用下连接成完整的 DNA 链 3 复制的起点 方向和速度 复制时 双链 DNA 要解开成两股链分别进行 所以这个复制起点成叉子形式 被称为复 制叉 DNA 复制是从固定起点开始的 一般把生物的复制单位称为复制子 一个复制子只 含有一个复制起点 通常细菌 病毒和线粒体 DNA 分子都是作为单个复制子完成复制的 而真核生物的基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制 即基因组中包含多个复制 子 原核生物和真核生物的 DNA 复制主要是从固定起点双向等速复制方式进行 4 几种主要的复制方式 1 线性 DNA 双链的复制 2 环状 DNA 双链的复制 型 滚环型 D 型 第四节 原核生物和真核生物 DNA 复制的特点 1 原核生物 DNA 复制的特点 所有的 DNA 复制都是从一个固定的起点开始的 而目前所知的 DNA 聚合酶都只能延长 DNA 链而不能从头合成 DNA 链 DNA 复制时 往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模版上合 成一段 RNA 引物 再由 DNA 聚合酶从 RNA 引物 3 末端开始合成新的 DNA 链 对于前 导链 这个引发过程比较简单只要有一段 RNA 引物 DNA 聚合酶就能以此为起点一直合 成下去 但对于滞后链 这个引发过程就非常复杂 需要多种蛋白质和酶的协同作用还涉 及到岗崎片段的形成和连接 滞后链的引发由引发体来完成 DNA 解链酶 DNA 解链酶能水解 ATP 获得能量来解开双链 DNA 单链结合蛋白 SSB 作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构 它以 四聚体形式存在于复制叉处 待单链复制完成后才离开 2 真核生物 DNA 复制的特点 真核生物每条染色体上可以有多个复制起点 而原核生物只有一个复制起点 真核生物的 染色体在全部完成复制前 各个起点上的 DNA 不能再开始 而在快速生长的原核生物中 复制起点可以连续开始新的 DNA 复制 表现为虽有一个复制单元 但却可有多个复制叉 第五节 DNA 的修复 1 错配修复 一旦复制叉通过复制起点 母链就会在开始 DNA 合成前的几秒至几分钟内 被甲基化 此后只要两条 DNA 链上碱基配对出现错误错配修复系统就会根据 保存母链 修复子链 的原则 找出错误碱基所在的 DNA 链 并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷 酸的 5 位置切开自恋 再根据错配碱基相对于 DNA 切口的方位启动修复途径 合成子链 2 切除修复 包括碱基切除修复和核苷酸切除修复 步骤 首先由核酸内切酶识别 DNA 1 的损伤位点 在损伤部位的 5 侧切开磷酸二酯键 由 DNA 解链酶将有损伤的 DNA 片段解 2 离 在 DNA 聚合酶的催化下 以完整的互补链为模板 按 5 3 方向合成 DNA 链 填补已 3 切除的空隙 由 DNA 链连接酶新合成的 DNA 片段与原来的 DNA 断链连接起来 4 3 重组修复 复制后修复 受损伤的 DNA 链复制时 产生的子代 DNA 在损伤的对应部位出现缺口 1 另一条母链 DNA 与有缺口的子链 DNA 进行重组交换 将母链 DNA 上相应片段填补母 2 链 DNA 的缺口 而母链 DNA 出现缺口 以另一条子链 DNA 为模板经 DNA 聚合酶催化合成一新的 DNA 片段填补母链 DNA 的缺 3 口 最后 DNA 连接酶连接 完成修补 4 DNA 的直接修复 5 SOS 反应 包括诱导 DNA 损伤修复 诱变效应 细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放 噬菌体等 包括两个方面 DNA 的修复和产生变异 第六节 DNA 的转座 1 转座子 是存在于染色体 DNA 上可自主复制和移位的基本单位 插入序列是最简单的 转座子 它不含任何宿主基因 它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成成分 第三章 生物信息的传递 从 DNA 到 RNA 第一节 RNA 转录的基本过程 1 RNA 链的合成都包括以下几个特点 RNA 是按照 5 3 方向进行的 以 DNA 中的反义 链为模版 在 RNA 聚合酶催化下 以四种三磷酸核苷为原料 根据碱基配对原则 各个 核苷酸之间通过形成磷酸二酯键相连 不需要引物的参与 合成的 RNA 带有与 DNA 有意 义链相同的序列 转录的基本过程包括 模版识别 转录起始 通过启动子及转录的延伸 和终止 2 模版的识别 主要是 RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程 真核生物的 RNA 聚合酶不能直接识别基因的启动子区 所以 需要一些被称为转录调控 因子的辅助蛋白质按特定的顺序结合在启动子上 RNA 聚合酶才能与之结合并形成复杂的 转录起始前复合物 PIC 以保证有效的起始转录 3 起始转录 不需要引物 转录的起始就是 RNA 链上第一个核苷酸键的产生 转录起始 后直到形成 9 个核苷酸短链的过程是通过启动子阶段 此时 RNA 聚合酶一直处于启动子 区 新生的 RN 链与 DNA 模版链的结合不够牢固 很容易从 dna 链上掉下来并导致转录重 新开始 一旦 RNA 聚合酶成功的合成了 9 个以上核苷酸并离开启动子区 转录就进入正 常的延伸阶段 一般来说 通过启动子的时间越短 该基因转录起始的频率也越高 4 转录的延伸 RNA 聚合酶释放 因子离开启动子后 核心酶沿模版 DNA 链移动并使 新生 RNA 链不断延长的过程就是转录的延伸 5 转录的终止 当 RNA 链延伸到转录终止位点时 RNA 聚合酶不在形成新的磷酸二酯键 RNA DNA 杂合物分离 转录泡瓦解 DNA 恢复成双链状态 而 RNA 聚合酶和 RNA 链都 被从模版上释放出来 这就是转录的终止 第二节 转录机器主要成分 1 RNA 聚合酶 原核生物 RNA 聚合酶 在细菌中 一种 RNA 聚合酶几乎负责所有的 1 mRNA rRNA tRNA 的合成 大多数原核生物的 RNA 聚合酶的组成是相同的 大肠杆 菌 RNA 聚合酶首先由 2 个 亚基 一个 亚基 一个 亚基和一个 亚基组成的核心酶 加上一个 亚基后则成为聚合酶全酶 转录的起始过程需要全酶 由 因子辨认起始点 延长过程仅需要核心酶的催化 大肠杆菌 RNA 聚合酶的组成分析 亚基相对分子质量亚基数组分功能 3 65x1042核心酶核心酶组装 启动子识别 1 51x1051核心酶 和 共同组成 RNA 合成的活性中心 1 55x1051核心酶 11x1041核心酶 7 0 x1041 因子存在多种 因子 用于识别不同的启动 子 真核生物的 RNA 聚合酶 2 酶细胞内定位转录产物相对活性对 鹅膏碱的敏感程度 RNA 聚合酶 核仁rRNA50 70 不敏感 RNA 聚合酶 核质hn RNA20 40 敏感 RNA 聚合酶 核质t RNA约 10 存在物种特异性 2 转录复合物 模版的识别阶段包括 RNA 聚合酶全酶对启动子的识别 聚合酶与启动子 可逆性结合形成封闭复合物 聚合酶全酶所结合的 DNA 序列中有一小段双链被解开 对 强启动子来说 从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的 是快反应 开放复合物与 最初的两个 NTP 相结合并在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括 RNA 聚合酶 DNA 和新生 RNA 的三元复合物 第三节 启动子与转录起始 1 启动子区的基本结构 启动子 是一段位于结构基因 5 端上游的 DNA 序列 能活化 RNA 聚合酶 使之与模版 1 DNA 链准确的结合并具有转录起始的特异性 因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能 否有效的形成二元复合物 启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力 从而影响了 基因的表达水平 Pribnow 区 是一个由 5 个核苷酸 TATTA 组成的保守序列 其中央大约位于起点上游 3 10bp 处 所以又称 10 区 35 区 在转录开始位点上游 35 区域也有一段保守序列 共同序列是 TTGACA 4 10 位的 TATA 区和 35 位的 TTGACA 区是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点 能与 因子 相互识别而具有很高的亲和力 2 启动子的识别 RNA 聚合酶并不直接识别碱基对本身 而是通过氢键互补的方式加以 识别 3 RNA 聚合酶与启动子区的结合 RNA 聚合酶首先与启动子区闭合双链 DNA 相结合 形成二元闭合复合物 然后经过解链得到二元开链复合物 一旦开链区解链 酶分子能以 正确的取向与解链后的有关单链相互作用 形成开链复合物 4 10 区与 35 区的最佳间距 在原核生物中 35 区与 10 区之间的距离大约是 16 19bp 小于 15bp 或大于 20bp 都会降低启动子活性 5 增强子及其功能 增强子是 DNA 上能提高转录起始效率的序列 可位于转录起始点的 5 或 3 端 而且一般与所调控的靶基因的距离无关 其特点如下 远距离效应 一般位于上游 200bp 处 但可增强远处启动子的转录 即使相距大于 10kb 1 也能发挥作用 无方向性 无论位于靶基因的上游还是位于靶基因的下游或内部都可发挥增强转录的作 2 用 顺式调节 只调节位于同一染色体上的靶基因 而对其他染色体上的基因没有作用 3 无物种和基因的特异性 可以连接到异源基因上发挥作用 4 具有组织特异性 增强子的作用需要特定的蛋白质因子参与 5 有相位性 其作用和 DNA 的构象有关 6 有的增强子可以对外部信号产生反应 7 6 转录的抑制 分为两类 第一类是 DNA 模版功能抑制剂 通过与 DNA 结合而改变模 版的功能 第二类是 RNA 聚合酶的抑制物 它们与 RNA 聚合酶结合而抑制其活力 第四节 原核与真核生物 mRNA 的特征比较 1 原核生物 mRNA 的特征 半衰期短 1 多以多顺反子的形式存在 2 5 端没有帽子结构 3 端也没有多聚 A 尾巴或者很短 3 2 真核生物 mRNA 的特征 5 端有帽子结构 1 绝大多数 3 端有 poly A 尾巴 2 凡是编码功能的真核基因都能通过 RNA 聚合酶 进行转录 真核基因几乎都是单顺反子 3 mRNA 只包含一个蛋白质信息 第五节 终止和抗终止 1 依赖于 因子的终止 因子能水解各种核苷三磷酸 实际是一种 NTP 酶 通过催化 NTP 的水解促使新生 RNA 链从三元转录复合物中解离出来 从而终止转录 2 不依赖于 因子的终止 模板上存在终止转录信号 终止子 每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子 终 止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的二重对称区 由这段 DNA 转录产生的 RNA 容易 形成发卡式结构 在终止位点前面有一段 4 8 个 A 组成的序列 因此转录产物的 3 端为寡 聚 U 这种结构特征的存在决定了转录的终止 3 抗终止 破坏终止位点的 RNA 的茎 环结构的抗终止和依赖于蛋白质因子的转录终止 第四章 生物信息的传递 从 mRNA 到蛋白质 1 翻译是指将 mRNA 链上的核苷酸序列从一个特定的起始位点开始 按 3 个核苷酸代表 一个氨基酸的原则 依次合成一条多肽链的过程 第一节 遗传密码 三联子 1 遗传密码的性质 密码的连续性 一个密码子接一个密码子连续的阅读直至终止密码 1 密码的简并性 由一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象称为简并 对应于同一氨基 2 酸的密码子称为同义密码子 密码的通用性和特殊性 遗传密码无论在体内还是在体外 也无论是对病毒 细菌 动 3 物还是植物而言都是通用的 特殊性 支原体中终止密码子 UGA 被用来编码色氨酸 密码子与反密码子的相互作用 在蛋白质生物合成过程中 tRNA 的反密码子在核糖体内 4 是通过碱基的反向配对与 mRNA 上的密码子相互作用的 在密码子与反密码子配对过程中 前两对严格遵守碱基配对原则 第三对碱基有一定的自由度 可以 摆动 因而使某些 tRNA 可以识别 1 个以上的密码子 第二节 tRNA 1 tRNA 在蛋白质合成过程中处于关键地位 它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供 了接合体 还为准确无误的将所需的氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体 所以 它又 被称为 第二遗传密码 2 tRNA 的结构 受体臂 accept stem 也被称作 amino acid stem 是一个 7 个碱基长的臂 其中包含 5 端 与有 3 端羟基 OH 能结合氨基酸于其上 的 3 端 受体臂有可能含有非 Watson Crick 所发现的碱基对 CCA 尾 CCA tail 是 tRNA 分子 3 端的 CCA 序列 在翻译时 帮助酶 识别 tRNA D 臂 D arm 是在一个环 D loop 的端部 4 个碱基的臂 通常含有二氢尿嘧啶 dihydrouridine 反密码子臂 anticodon arm 有 5 个碱基 包括反密码子 anticodon 每一 tRNA 包括一 个特异的三联反密码子序列 能够与氨基酸的一个或者多个密码子匹配 例如赖氨酸 lysine 的密码子之一是 AAA 相应的 tRNA 的反密码子可能是 UUU 一些反密码子可 以与多于一个的密码子匹配被称为 摆动 T 臂 T arm 是 5 个碱基的茎 包括序列 T C 3 tRNA 的功能 运输的工具转运氨基酸 解读 mRNA 的信息 4 tRNA 种类 起始 tRNA 和延伸 tRNA 能特异性的识别 mRNA 模板上起始密码子的 tRNA 叫 tRNA 1 其他的统称为延伸 tRNA 同工 tRNA 代表同一种氨基酸的 tRNA 叫同工 tRNA 2 校正 tRNA 分为无义突变和错义突变校正 3 5 氨酰 tRNA 合成酶 是一类催化氨基酸与 tRNA 结合的特异性酶 由它决定氨基酸能否 与对应的 tRNA 结合 既能识别 tRNA 又能识别氨基酸 对两者都具有高度的专一性 催化反应 AA tRNA ATPAA tRNA AMP PPi 第三节 核糖体 1 核糖体的结构 核糖体由大小两个亚基组成 每个亚基都含有一个相对分子质量较大的 tRNA 和许多不同 1 的蛋白质分子 核糖体蛋白 核糖体上有多个活性中心 每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成 2 形成一个多种酶的结合体 单个酶或蛋白质只有在这个总体结构上才拥有催化性质 他们 共同承担了蛋白质生物合成的任务 核糖体 RNA 3 2 核糖体的功能 合成的场所 选择对信息专一的 AA tRNA 同时容纳另一种携带肽链的 tRNA 既肽基 tRNA 核糖体包括至少五个活性中心 mRNA 结合部位 结合或接受 AA tRNA 部位 结合或接受肽基 tRNA 的部位 肽基转移 部位及形成肽键的部位 第四节 蛋白质合成的生物学基质 1 氨基酸的活化 氨基酸必须在氨酰 tRNA 合成酶的作用下生成活化氨基酸 AA tRNA 2 翻译的起始 原核生物翻译的起始 1 需要的 7 种成分 30S 小亚基 模版 mRNA fMet tRNA fMet 三个翻译起始因子 IF 1 IF 2 IF 3 GTP 50S 大亚基 Mg2 第一步 30S 小亚基首先与翻译起始因子 IF 1 IF 3 结合 通过 SD 序列与 mRNA 模版结 合 第二步 在 IF 2 和 GTP 的帮助下 fMet tRNA fMet进入小亚基的 P 位 tRNA 上的反密码子 与 mRNA 上的起始密码子配对 第三步 带有 tRNA mRNA 三个翻译起始因子的小亚基复合物与 50S 大亚基结合 GTP 水解 释放翻译起始因子 3 肽链的终止 肽链延伸过程中 当终止密码子 UAA UAG UGA 出现在核糖体的 A 位时 没有相应的 AA tRNA 能与其结合 而释放因子能识别这些密码子并与之接合 水解 P 位上的多肽链与 tRNA 之间的二酯键 然后 新生成的肽链和 tRNA 从核糖体上释放 核糖体大小亚基解体 蛋白质合成结束 4 蛋白质前体的加工 新生的多肽链大多是没有功能的 必须经过加工修饰才能转变为有 活性的蛋白质 N 端 fMet 或 Met 的切除 二硫键的形成 特定氨基酸的修饰 切除新生肽 链中的非功能片段 5 蛋白质的折叠 新生肽链在细胞内的特定部位 在多种蛋白质的帮助下卷曲成正确构象 大多数蛋白质的折叠是边翻转边折叠的 至少两类因子参与了折叠过程 酶 分子伴侣 6 蛋白质合成抑制剂 主要是一些抗生素 如嘌呤霉素 链霉素 四环素 氯霉素 红霉 素 抗生素对蛋白质合成的作用可能是阻止 mRNA 与核糖体结合 氯霉素 或阻止 AA tRNA 与核糖体结合 四环素 或干扰 AA tRNA 与核糖体结合而产生错读 链霉素 专题七 双向电泳与质谱检测 掌握双向电泳中等电聚焦电泳和 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 掌握双向电泳的步骤 掌握质谱分析的基本原理 掌握质谱仪的基本结构 掌握质谱技术在蛋白质研究中的应用领域 了解蛋白质电泳凝胶染色的方法 了解双向电泳的应用及优缺点 蛋白质电泳技术 1 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 等电聚焦 3 双向电泳 1 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质 如核酸 蛋白质 通过附加电场 使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离 2 蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型 按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳变性电泳和非变性电泳 3 蛋白质变性 打开二硫键 蛋白质失去生物活性 故称变性 denature 4 变性的方法 95 加热 5 分钟 为避免复性常使用 巯基乙醇或二硫苏糖醇 DTT 保护自由的半胱氨酸巯基 5 变性电泳的方法 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 6 SDS PAGE 原理 蛋白质在 SDS 凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其分子量 分子量 7 SDS PAGE 操作程序 蛋白质样品制备 凝胶制备 分离胶 浓缩胶 样品上样 电泳 凝胶染色 脱色 电泳 结果分析 SDS PAGE 凝胶的工作原理 制胶缓冲液使用的是 Tris HCl 缓冲系统 浓缩胶是 pH6 8 分离胶 pH8 8 而电泳缓冲液使用 Tris 甘氨酸甘氨酸缓冲系统 浓缩胶中 pH 呈弱酸性 甘氨酸解离很少 在电场中泳动效率低 而 Cl 却很高 两者之 间形成导电性较低的区带 蛋白分子就介于二者之间泳动 由于导电性与电场强度成反比 这一区带便形成了较高的电压梯度 压着蛋白质分子聚集到一起 浓缩为一狭窄的区带 进入分离胶后 胶中 pH 增加 呈碱性 甘氨酸大量解离 泳动速率增加 直接紧随氯离 子之后 同时由于分离胶孔径的缩小 在电场的作用下 蛋白分子根据其固有的带电性和 分子大小进行分离 SDS PAGE 电泳凝胶染色 考马斯亮蓝染色 银染 2 等电聚焦 等电聚焦 是利用有 pH 梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术 由于其分辨 率可到达 0 01pH 单位 因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分 适用 1 研究蛋白质微观不均一性 2 测定蛋白质等电点 pH 梯度构建 固相 pH 梯度 IPG 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而 建立 pH 梯度 线性和非线性 分辨率比前者高一个数量级 载体两性电解质 CA 应具备的条件 在等电点处必需有足够的缓冲能力 在等电点必需有足够高的电导 分子量要小 便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开 化学组成应不同于被分离物质 不干扰测定 应不与分离物质反应或使之变性 3 双向电泳 蛋白质组学 阐明各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科 包 括鉴定蛋白质的表达 存在方式 修饰形式 结构 功能和相互作用等 是蛋白质 蛋白质 protein 和基因组 和基因组 genome 研究在形式和内容两方面的组合 蛋白质组学关键技术关键技术 由于蛋白质分离 双向电泳和高效液相层析技术 和鉴定技术 现代质谱 蛋白质分离 双向电泳和高效液相层析技术 和鉴定技术 现代质谱 的进 步 以及基因组学和生物信息学基因组学和生物信息学的交叉渗透 蛋白质组学研究已经获得了长足的发展 双向电泳技术 等电聚焦 Isoelectric focusing IEF 及 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 SDS PAGE 双向电泳 技术 即先进行等电聚焦电泳 先进行等电聚焦电泳 按照 pI 分离 然后再进行再进行 SDS PAGE 按照分子大小 经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图 双向电泳的实验流程 样品制备 蛋白质定量 上样 第一向等电聚焦电泳 胶条的平衡 第二向 SDS PAGE 电泳 蛋白质点检测 染色 生物信息学分析 鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图肽质谱指纹图 peptide mass fingerprinting PMF 和数据 库搜寻匹配 双向电泳技术的优缺点 优点 可以从复杂蛋白质得到单一蛋白质 可以观察到同一蛋白质的异构体和不同的修饰 和质谱技术兼容 分辨率较高 信息化程度高 缺点 低拷贝蛋白 过大过小蛋白 极酸极碱蛋白 疏水性膜蛋白等检测苦难 稳定性差 双向电泳技术的应用 分离复杂组分蛋白质 蛋白质表达谱研究 差异蛋白质组学研究 生物质谱技术 质谱的基本原理 质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种方 法 被分析的样品首先要离子化离子化 然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同 把 离子按质荷比质荷比 m z 分开而得到质量图谱质量图谱 通过样品的质量图谱和相关信息 可以得到样 品的定性定量结果 质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器 实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比 m z or m e 生物质谱 不仅可以测定生物大分子的质量生物大分子的质量 还可以解析其分子结构 修饰位点和修饰类型分子结构 修饰位点和修饰类型 等属性 是蛋白质组学研究最有力和最重要的工具之一 质谱仪的基本结构 进样系统 离子源 质量分析器 离子检测器 串联质谱 三 常见生物质谱离子源 基质辅助的激光解析质谱 MALDI 电喷雾质谱 ESI MS MALDI TOF 的工作原理 将蛋白质酶解成小肽段后与基质 主要是有机酸 混合 将样 品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶 然后用激光轰击 将呈离子化气体状态的待 分析物从靶表面喷射出去 离子化气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的 质量和其所带电荷数的比值 m z 决定 四 与生物质谱联用的分离技术 气相色谱 质谱联用 高效液相色谱 质谱联用 毛细管电泳 质谱联用 五 质谱在蛋白质组学中的应用 蛋白质鉴定 蛋白质突变的检测与鉴定 验证重组蛋白或重组肽的结构和纯度 翻译后修饰的检测 1 蛋白质鉴定的路线 I 通过肽质量指纹图 peptide mass fingerprinting PMF 和数据 库搜寻匹配 II 通过测出样品中部分肽段部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻 匹配 2 肽指纹图谱 PMF 鉴定 原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息与实际测 得的质量信息进行对比而实现鉴定 PMF 鉴定的优点与缺点 优点 是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法 算法简单 速度快 缺点 质量相近的多肽增加匹配难度 无法实现混合蛋白的鉴定 二级质谱鉴定质谱仪选择一级质谱中的一个峰一级质谱中的一个峰 让这些峰所代表的离子高速撞击质谱仪中 的惰性气体 使其肽键断裂 并对库搜索鉴定蛋白质 优点 鉴定准确度更高 可以得到蛋白的序列 可以实现多个蛋白的鉴定 缺点 增加了一步操作 算法更复杂 而且需要更多的操作经验 翻译后修饰的检测 糖基化修饰 磷酸化修饰 练习题 在双向电泳技术中 SDS PAGE 电泳是按照蛋白质的 C 进行分离 A 等电点 B 电荷数 C 分子量 D 结构类型 双向电泳研究时 先进行等电聚焦 再进行 SDS PAGE Y 双向电泳可用于差异蛋白质组学研究 Y 双向电泳研究时 蛋白样品制备时要尽量避免蛋白质的降解 Y 对于双向电泳所得到的差异蛋白点 需要利用质谱技术进行鉴定 Y 生物质谱既可以测定生物大分子的质量 还可以解析其分子结构 Y 下列哪个不是质谱仪的基本结构成分 A A 生物传感器 B 离子源 C 质量分析器 D 离子检测器 质谱用于蛋白质鉴定时 一般先通过肽质量指纹图 如果得不到结果再利用二级质谱 Y 质谱技术可用于验证重组蛋白或重组肽的结构和纯度 Y 质谱技术可用于检测蛋白质突变 Y 专题八 基因功能研究方法 掌握定点突变技术的定义和方法 掌握基因敲除的定义 掌握哺乳动物基因敲除的步骤 掌握 RNA 干扰的定义 了解 RNA 干扰的原理和研究方法 了解什么是基因过量表达 一 基因定点突变 site directed mutagenesis 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列 用于研究某个 些 氨基酸残基对蛋白质的结构 催化活性以及结合配体能力的影响 也可用于改造 DNA 调控元件特征序列 修饰表达载体 引入新的酶切位点等 主要采用两种 PCR 方法 重叠延伸技术重叠延伸技术 g