基因组文库的构建.ppt

第六章DNA文库的构建和目的基因的筛选 对于高等真核生物而言 基因组DNA十分庞大 基因可达数万个 且基因组成结构复杂 除编码序列 还有非编码序列及调控序列 基因间还存在大量的间隔序列和重复序列 因此 单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小 除少数例外 绝大多数基因难以直接分离得到 为了解决这个难题 一种可行的方法就是将这个基因扩增 增加成功分离目的基因的可能性 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因 因此无法对它进行特异性扩增 只能构建该生物材料的基因文库 然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来 最后分离得到目的基因 基因组文库 Genomiclibrary 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段 再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落 这个群体就称为该生物基因组文库 其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因 第一节基因组DNA文库的构建 一 基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为 质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 人工染色体文库 细菌人工染色体文库 酵母人工染色体文库 二 基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存 扩增 筛选 三 基因组DNA文库构建的程序 载体DNA的制备 高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备 高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞 重组克隆的挑选和保存 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 四 生物基因组DNA文库的构建 一 生物基因组DNA的提取染色体DNA 二 基因组DNA的不完全酶切 1 根据实验需要选择合适的限制性内切酶a 四个识别位点的限制酶出现的几率 1 256b 六个识别位点的限制酶出现的几率 1 10242 分离目的酶切片段大小的确定a 克隆单个基因 10kbb 克隆基因族 20kb3 DNA不完全酶切条件的确定a 确定限制酶用量 改变酶切时间b 固定酶切时间 改变限制酶的用量 DNA的不完全酶切 三 酶切片段与克隆载体连接 酶切片段的分离与纯化 低熔点琼脂糖回收目的片段 试剂盒回收目的片段 2 酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a 质粒载体可承载15kbDNA左右片段 有效的范围为 10kb b 载体可承载25kbDNA左右片段 有效的范围为15kb c Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段 有效的范围为 40kb 四 重组 转化受体细胞 根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞 DH5 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株 可与pUC编码的 半乳糖苷酶氨基端实现 互补 HB101 用于大规模制备质粒的抑制型菌株 转化效率高JM101 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ 1 温度敏感的溶源性菌株 用于含有噬菌体 启动子质粒载体的宿主菌 重组质粒转化受体细胞 1 转化法 transformation 2 转导法 transduction 3 转染法 transfection 五 基因组DNA文库克隆子的保存与筛选 1 基因组DNA文库的保存1 影印膜滤保存法 2 文库在液体培养基中扩增保存 方法 从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中 混合的细菌生长数代后 其培养物于 70oC储存 加终浓度为25 的甘油 缺点 因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少 3 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法 从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中 菌体生长到一定浓度后 加入终浓度为25 的甘油 于 70oC或 25oC下保存 缺点 需保存的克隆子数过多 工作量大 2 基因组文库的筛选 分子杂交法 利用分子探针对文库进行筛选PCR筛选法 根据保守序列合成引物 扩增特异性片段 基因文库的筛选与鉴定 PCR筛选法利用合适的引物 以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR 通过对PCR产物的电泳分析 确定目的基因是否插入到载体中 菌落原位杂交法 colonyinsituhybridization 1975年 M Grunstein和D Ho