天然药物化学第1章总论.ppt

天然药物化学 ChemistryofNaturalProducts 卫生部规划教材 主编 吴立军 ChemistryofNaturalProducts 第一章 总论 Generation 基本内容 天然药物化学的概念 研究范围 研究目的与任务 有效成分与无效成分的概念 各类化合物化学成分简介 一次代谢与二次代谢的概念 主要的生物合成途径 1H NMR 13C NMR的基本概念及常见的13C NMR谱的特征及解析方法 质谱的类型及应用特点 旋光光谱 ORD 基本概念 原理及测定意义 八区律应用于含有羰基化合物的判定方法 基本要求 掌握13C NMR谱特征及其解析方法 常用的提取 分离方法 熟悉天然药物化学的研究范围 课程的学习重点 各类化合物的生物合成途径 了解ORD谱的应用范围及八区律使用方法 本章内容 第一节概述第二节各类成分简介第三节生物合成第四节提取分离方法第五节结构研究方法 第一节绪论 Exordium 一 天然药物化学的概念 1 天然药物化学 是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科 2 研究内容 主要指天然药物的化学成分 多为有效成分 的结构特点 理化性质 提取分离方法 结构鉴定及生合成途径 第一节绪论 Exordium 二 相关学科1 药物化学 MedicinalChemistry 合成药物 构效关系2 植物化学 Phytochemistry 仅研究植物3 中药化学 ChemistryofTCM 结合中医药理论及临床经验 三 天然药物植物 动物 矿物 微生物等来源的药物 人参 银杏 芍药 山茱萸 雄黄 天然冬虫夏草 第一节绪论 Exordium 四 基本概念1 有效成分 天然药物中具有一定的生物活性 能起到治疗作用的单体化合物 2 有效部位 为混合物 临床有效 如人参总皂苷 五 学习天然药化的目的和意义 1 探索中药防病治病的机理 2 改进剂型 提高疗效 3 提高中药及制剂的质量 4 提供中药炮制现代科学依据 5 开辟药源 开发新药 第一节绪论 Exordium 第一节绪论 Exordium 六 天然药物化学研究方法1 整理调查a 原植物 品种 科 属 学名 来源 产地 b 文献 近源植物具有相似的成分 2 成分分离系统分离法 活性跟踪法3 成分鉴定理化性质 色谱方法 波谱方法4 结构改造 发现和创制新药 本章内容 第一节绪论第二节各类成分简介第三节生物合成第四节提取分离方法第五节结构研究方法 第二节各类成分简介 化学成分分类1 生物碱类 Alkloids 含N原子 多呈碱性 2 糖苷 Glycosides 糖 单糖 低聚糖 多糖 淀粉 纤维素 甲壳素 果胶 树胶 粘液质 苷 糖 苷元 黄酮酸性香豆素蒽醌 第二节各类成分简介 三萜皂苷皂苷甾体皂苷 中性 强心苷 3 挥发油 第二节各类成分简介 4 有机酸 含COOH 多以盐的形式存在 5 树脂 为组成复杂的混合物 多与挥发油 树胶 有机酸混合 如 安息香 乳香等 6 其它成分 1 氨基酸 蛋白质 2 鞣质 多酚类化合物 3 色素类叶绿素 胡萝卜素等 4 油脂和腊油脂多为一分子甘油与水分子脂肪酸成的酯 5 无机成分 本章内容 第一节绪论第二节各类成分简介第三节生物合成第四节提取分离方法第五节结构研究方法 第三节生物合成 一次代谢产物 糖 蛋白质 脂质 核酸等对植物机体生命活动来说不可缺少的物质 二次代谢产物 生物碱 萜 香豆素 黄酮 醌类等对维持植物生命活动不起重要作用 且并非在所有植物中都能产生 由一次代谢产物产生 常为有效成分 一 基本概念 第三节生物合成 1 醋酸 丙二酸途径AA MA途径 合成脂肪酸类 酚类 蒽醌类2 甲戊二羟酸途径 途径 主要生成萜类 甾体类化合物3 桂皮酸途径和莽草酸途径形成具C6 C3骨架的化合物 如香豆素 木脂素 黄酮等 二 天然化合物的主要生物合成途径如下 第三节生物合成 4 氨基酸途径 AminoAcidPathway 合成生物碱5 复合途径 1 醋酸 丙二酸 莽草酸途径 2 醋酸 丙二酸 甲戊二羟酸途径 3 氨基酸 甲戊二羟酸途径 4 氨基酸 醋酸 丙二酸途径 5 氨基酸 莽草酸途径三 生物合成的意义 天然化合物结构分类 结构推测 植物化学分类学 仿生合成等 本章内容 第一节绪论第二节各类成分简介第三节生物合成第四节提取分离方法第五节结构研究方法 第四节提取分离方法 从中草药或天然药物中寻找未知有效成分或有效部位时 情况就比较复杂 只能根据预先确定的目标 在适当的活性测试体系指导下 进行提取 分离并以相应的动物模型筛选 临床验证 反复实践 才能达到目的 提取 利用适当的溶剂或方法 将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程 分离 将提取物中所含的各种成分一一分开 并将得到的单体加以精制的过程 第四节提取分离方法 一 提取法 1 溶剂提取法 extractionwithsolvent 溶剂提取法 根据天然成分的溶解性不同 选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂 将所需成分从生物材料中溶解出来的一种提取方法 原理 相似相溶只要中草药成分的极性与溶剂的极性相当 就会在其中有较大的溶解度 即所谓 相似相溶 的规律 化合物的极性决定于分子中所含的官能团及分子结构 团基极性按下列次序增加 CH3 CH O R NO2 OCOR CHO COR NH2 OH COOH 第四节提取分离方法 一 提取法 1 溶剂提取法 extractionwithsolvent 化合物的结构与亲水性 亲脂性的关系 1 分子结构中亲水性基团 羧基 羟基 氨基 越多 极性越大 亲水性越强 反之则亲脂性越强 2 分子中非极性部分越大 碳链越长或结构越大 则亲脂性越强 3 结构母核相同的成分 分子中功能基的极性越大 或极性功能基数量越多 则整个分子的极性越大 亲水性越强 亲脂性越弱 第四节提取分离方法 一 提取法 1 溶剂提取法 extractionwithsolvent 极性溶剂是指含有羟基或羰基等极性基团的溶剂 其极性强 介电常数大 水 最大 乙腈 甲醇 乙醇 丙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 二氯甲烷 氯仿 甲苯 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 石油醚 最小 理想溶剂 idealsolvents 1 对有效成分溶解度大 2 对无效成分溶解度小 3 与有效成分不起化学反应 4 安全 成本低 易得 第四节提取分离方法 一 提取法 1 溶剂提取法 extractionwithsolvent 溶剂的选择 1 水 为价廉 易得 使用安全的强极性溶剂 适于提取无机盐 糖 氨基酸 蛋白质 有机酸盐 生物碱盐 苷类等 2 亲水性有机溶剂 以乙醇最常用 高浓度提取亲脂性成分 低浓度提取亲水性成分 3 亲脂性有机溶剂 具有较强的选择性 对挥发油 油脂 叶绿素 树脂 内酯 某些生物碱及一些苷元均可提取出来 优缺点 沸点低 浓缩回收方便 但易燃 有毒 价贵 穿透力差 第四节提取分离方法 一 提取法 1 溶剂提取法 extractionwithsolvent 溶剂提取的方法 连续回流提取法 回流提取法 煎煮法 渗漉法 浸渍法 Simplepercolateassembly 1 冷提 适用于受热不稳定的成分 浸渍 Maceration 渗漉 Percolation 第四节提取分离方法 耗时长 溶剂用量大 对原料粒度要求也高 工业生产用的渗漉装置 第四节提取分离方法 2 热提 煎煮法 Decoction 回流 Refluxing 连续回流 ContinuousRefluxing Simplerefluxingassembly AssemblyofSoxhletextractor 第四节提取分离方法 对遇热易破坏和挥发性成分有影响 第四节提取分离方法 影响溶剂提取法的因素 1 生物材料的粉碎度材料细 面积大 扩散快 效果好 但是太细 吸附作用大 易糊化 扩散慢 同时植物细胞也会遭受破坏 大量蛋白质 淀粉被提出 产生沉淀或胶束状 影响提取 花 叶可适当粗些 皮 茎 根宜细些 2 提取温度一般使用常温 在不破坏有效成分的条件下加热不要超过80 C 温度低提取时的杂质少 温度高时提取效率高 但含淀粉 粘液质较多的材料 水提时避免热提 3 提取时间以提完为准 是否完全可以提取也做定性实验 或薄层层析检测 或以液体颜色判断 4 浓度差根据扩散原理 造成提取液的浓度差可以提高提取的效率 可采取的措施有 搅拌 更换溶剂 2 水蒸气蒸馏法 water steamdistillation 提取具有挥发性 能随水蒸气蒸馏 与水互不相溶且不被破坏的成分 如挥发油 第四节提取分离方法 3 升华法 sublimation 用于具有升华性的成分提取 如香豆素 蒽醌 樟脑等 第四节提取分离方法 樟木中的樟脑 茶叶中的咖啡因的提取 2 莰酮 咖啡因 超临界流体的密度与液体很接近 而它又具有气体扩散性能常用的临界流体有CO2 N2O 乙烷 丙烷等 4 超临界流体提取法 supercriticalfluidextractionSFE 利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取 为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法 第四节提取分离方法 控温面板 高压泵 超临界CO2萃取实验装置示意图 原料 超临界萃取实验装置与实验方法 小试实验装置图 实验装置 小试实验装置 上世纪50年代初进入试验阶段 如从石油中脱沥青70 80年代 SFE越来越多的用于食品 香料的提取90年代 开始从植物药中提取成分 如蛇床子 茵陈蒿 桑白皮中提取成分 中小型SFE装置图 为物理过程 无化学反应 生物活性不减 大能量的超声波产生的极大压力造成植物物细胞壁及整个生物体破裂 胞内物质的释放 扩散及溶解 5 超声提取法 ultrasonicextraction 实验室用小型超声仪 第四节提取分离方法 工业生产用超声仪 6 微波提取法 microwaveextraction 具有穿透力强 选择性高 加热效率高等显著特点 而且其操作简便 快速 节能 高效 缺点 工业化设备少 成分变化 生物活性变化 工业生产用微波提取罐 第四节提取分离方法 第四节提取分离方法 二 分离方法 根据物质溶解度差别进行分离 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 根据物质的吸附性差别进行分离 根据物质分子大小差异进行分离 第四节提取分离方法 二 分离方法 根据溶解度差别进行分离1 1 利用温度不同引起溶解度的改变1 2 改变混合溶剂的极性1 3 调节溶液的pH值 改变分子的存在状态1 4 沉淀法 第四节提取分离方法 二 分离方法 1 根据溶解度差别进行分离1 1利用温度不同引起溶解度的改变 结晶法 结晶法是选用合适的溶剂 将混合物加热溶解 形成有效成分的饱和溶液 趁热过滤除去不溶的杂质 滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置 使有效成分大部分析出结晶 结晶溶剂选择的一般原则 对欲分离的成分热时溶解度大 冷时溶解度小 对杂质冷热都不溶或冷热都易溶 沸点要适当 不宜过高或过低 如乙醚 1 根据溶解度差别进行分离1 1利用温度不同引起溶解度的改变 结晶法 结晶法是选用合适的溶剂 将混合物加热溶解 形成有效成分的饱和溶液 趁热过滤除去不溶的杂质 滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置 使有效成分大部分析出结晶 结晶溶剂选择的一般原则 对欲分离的成分热时溶解度大 冷时溶解度小 对杂质冷热都不溶或冷热都易溶 沸点要适当 不宜过高或过低 如乙醚 第四节提取分离方法 二 分离方法 根据溶解度差别进行分离1 2 改变混合溶剂的极性在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性 使一部分物质沉淀析出 从而实现分离 水提醇沉法 在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇 以沉淀除去多糖 蛋白质等水溶性杂质 醇提水沉法 在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释 放置以沉淀除去树脂 叶绿素等水不溶性杂质 在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚 醇 醚法 或丙酮 醇 丙酮法 可使皂苷沉淀析出 第四节提取分离方法 二 分离方法 根据溶解度差别进行分离1 3 调节溶液的pH值 改变分子的存在状态对酸性 碱性或两性有机化合物来说 常可通过加入酸 碱以调节溶液的pH值 改变分子的存在状态 游离型或解离型 从而改变溶解度而实现分离 内酯类化合物不溶于水 但遇碱开环生成羧酸盐溶于水 再加酸酸化 又重新形成内酯环从溶液中析出 从而与其它杂质分离 生物碱一般不溶于水 遇酸生成生物碱盐而溶于水 再加碱碱化 又重新生成游离生物碱 酸可以分为强酸性 弱酸性和酚性 它们分别溶于碳酸氢钠 碳酸钠和氢氧化钠 借此可进行分离 第四节提取分离方法 二 分离方法 根据溶解度差别进行分离1 4沉淀法 铅盐沉淀法分醋酸铅及碱式醋酸铅 能与多种化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀 故可利用这种性质使有效成分与杂质分离 中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐 碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广 试剂沉淀法在生物碱盐的溶液中 加入某些生物碱沉淀试剂 则生物碱生成不溶性复盐而析出 用明胶 蛋白溶液沉淀鞣质 胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等 2 1影响分离的因素 分离因子 分配系数K KA KBKA KB K CU CL CU CL被分离物质在上相和下相中浓度 根据 值的大小可决定分离采用的方法 100 简单的一次萃取 可基本分离 100 10 10 12次萃取 CCD法 2 100次以上萃取 DCCC法 第四节提取分离方法 2 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 或用PC法求 值 选择理想分离条件 纸色谱 PC 也叫纸分配色谱 PPC PaperPartitionChromatography 纸色谱定数 Rfa Rfb为A B两物质在PC上Rf值 第四节提取分离方法 2 1影响分离的因素 pH值对于酸性 碱性 两性化合物 pH值可改变它们的存在状态 游离型和解离型 分配比受pH值的影响 因为 HA达到99 解离时 pH pKa 2HA达到99 游离时 pH pKa 2 第四节提取分离方法 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 2常用方法 1 液 液萃取法 2 液 液分配色谱 LC或LLC 3 逆流分配法 CCD 4 液滴逆流色谱法 DCCC 5 高速逆流色谱法 HSCCC 6 气液分配色谱 GC或GLC 7 逆流连续萃取法 1 液 液萃取法利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法 萃取时如果各成分的分配系数相差越大 分离效率越高 水提取液中的有效成分是亲脂性的物质 一般多用亲脂性有机溶剂 如苯 氯仿或乙醚进行两相萃取 有效成分是偏于亲水性的物质 需用弱亲脂性的溶剂 例如乙酸乙酯 丁醇等 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 1 液 液萃取法提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取 提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇 异戊醇和水作两相萃取 操作 如果容易产生乳化 大量提取时要避免猛烈振摇 可延长萃取时间 如碰到乳化现象 可将乳化层分出 再用新溶剂萃取 或将乳化层抽滤 或将乳化层稍稍加热 或较长时间放置并不时旋转 令其自然分层 水提取液的浓度最好在比重1 1 1 2之间 过稀则溶剂用量太大 影响操作 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱 正相色谱 固定相极性大 如水 缓冲液等 流动相极性小 如氯仿 乙酸乙酯等 载体 硅胶 含水可达17 硅藻土 纤维素等 分离极性大或水溶性成分 如苷类 糖 生物碱等 洗脱顺序 极性小的物质先被洗脱出来 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱 反相色谱 固定相极性小于流动相 如HPLC反相柱 反相板 固定相 硅胶硅醇基结合烷基 如RP 2 RP 8 RP 18 亲脂性 RP 18 RP 8 RP 2 流动相 洗脱剂 MeOH H2O CH3CN H2O洗脱顺序 分离极性大的成分 极性大者先洗脱下来 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱之高效液相色谱 HPLC HPLC是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的塔板理论 并采用了高压输液泵 高效固定相和高灵敏度的检测器 具有分析速度快 分离效率高和操作自动化特点的一种色谱技术 HPLC特别适合高沸点 大分子和热稳定性差的化合物的分离分析 高效液相色谱正是以其稳定 可靠 高效的特点成为中药研究的最重要的分析方法 常用于中药质量的控制 天然药物化学成分的分离及分析测定等 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 检测器是液相色谱的三大关键部件 高压输液泵 高效色谱柱和检测器 之一 其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步 理想的检测器应具有以下特点 灵敏度高 对温度变化和流量波动不敏感 死体积小 不使峰额外地扩展 对溶剂无响应 能用于梯度洗脱操作 线性范围宽 对所有样品都有响应 对样品无破坏性 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱之高效液相色谱 HPLC 常用的HPLC检测器 紫外 可见分光检测器示差折光检测器二极管阵列检测器蒸发光检测器溶质颗粒气体在检测池发生散射作用 经光电倍增管成电信号输出 无必须具有吸收紫外光的生色团 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱之高效液相色谱 HPLC 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 液 液分配柱色谱之高效液相色谱 HPLC 高效液相色谱的应用 中药化学成分分析成分分离制备 1 特别适用于极性较大的成分 如皂苷类 分离 2 先以分析色谱摸索分离条件 3 样品一定要用流动相溶解 再以滤膜过滤 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 三根据物质的吸附性差别进行分离 在天然有机化合物分离及精制工作中 吸附现象利用得十分广泛 其中又以固 液吸附用得最多 其分 物理吸附 表面吸附 physicaladsorption 以硅胶 氧化铝及活性炭为吸附剂化学吸附 chemicaladsorption 半化学吸附 semichemicaladsorption 聚酰胺层析 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 1 物理吸附 液 固物理吸附色谱是运用较多的一种方法 特别适用于很多中等分子量的样品的分离 尤其是脂溶性成分 一般不适用于高分子量样品如蛋白质 多糖或离子型亲水性化合物等的分离 吸附层析的分离效果 决定于吸附剂 溶剂和被分离化合物的性质这三个因素 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 吸附剂 硅胶 氧化铝 活性炭 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 硅胶 层析用硅胶为一多孔性物质 分子中具有硅氧烷的交链结构 同时在颗粒表面又有很多硅醇基 硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关 硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分 因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低 硅胶是一种酸性吸附剂 适用于中性或酸性成分的层析 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 氧化铝 氧化铝带有碱性 对于分离一些碱性中草药成分 如生物碱类的分离颇为理想 但是氧化铝不宜用于醛 酮 酸 内酯等类型的化合物分离 因为碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应 如异构化 氧化 消除反应等 用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝 不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质 并可使氧化铝颗粒表面带有NO3 或Cl 的阴离子 从而具有离于交换剂的性质 适合于酸性成分的层析 这种氧化铝称为酸性氧化铝 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 活性炭 是一种非极性吸附剂 活性炭主要用于分离水溶性成分 如氨基酸 糖类及某些甙 活性炭为吸附作用 在水溶液中最强 在有机溶剂中则较低弱 故水的洗脱能力最弱 而有机溶剂则较强 例如以醇 水进行洗脱时 则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加 活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物 对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物 利用这些吸附性的差别 可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开 单糖与多糖分开 氨基酸与多肽分开 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 吸附剂的特点 硅胶和氧化铝为极性吸附剂 有以下特点 对极性物质具有较强的亲和能力 故同为溶质 极性强者将被优先吸附 溶剂极性越弱 则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力 溶剂极性增强 则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱 溶质即使被硅胶 氧化铝吸附 但一旦加入极性较强的溶剂时 又可被后者置换洗脱下来 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 吸附剂的特点 活性炭因为是非极性吸附剂 故与硅胶 氧化铝相反 对非极性物质具有较强的亲和能力 在水中对该类物质表现出强的吸附能力 溶剂极性降低 则活性炭对该类物质的吸附能力也随之降低 故从活性炭上洗脱被吸附物质时 洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的减弱而增强 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 溶剂 洗脱剂的选择 须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑 在用极性吸附剂进行层析时 当被分离物质为弱极性物质 一般选用弱极性溶剂为洗脱剂 被分离物质为强极性成分 则须选用极性溶剂为洗脱剂 如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂 如以硅藻土或滑石粉代替硅胶 则洗脱剂的极性亦须相应降低 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 被分离物质的性质 被分离的物质与吸附剂 洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素 彼此紧密相连 在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下 各个成分的分离情况 直接与被分离物质的结构与性质有关 对极性吸附剂而言 成分的极性大 吸附性强 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 化合物的极性及其强弱判断 官能团的极性强弱 化合物的极性则由分子中所含官能团的种类 数目及排列方式等综合因素所决定 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 官能团的极性强弱 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 化合物的极性 化合物的极性则由分子中所含官能团的种类 数目及排列方式等综合因素所决定 极性基团的数目愈多 化合物的极性越大 被吸附的性能就会更大些 在同系物中碳原子数目少些 被吸附也会强些 总之 只要两个成分在结构上存在差别 就有可能分离 关键在于条件的选择 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 化合物的极性 被分离物质极性很小为不含氧的萜烯 或虽含氧但非极性基团 则需选用吸附性较强的吸附剂 并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱 但多数中药成分的极性较大 则需要选择吸附性能较弱的吸附剂 一般 级 采用的洗脱剂极性应由小到大梯度递增 或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况 此外 能否获得满意的分离 还与选择的溶剂梯度有很大关系 多组分的混合物 象植物油脂系由烷烃 烯烃 甾醇酯类 甘油三酸醋和脂肪酸等组份 当以硅胶为吸附剂时 使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱 油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 吸附簿层色谱 薄层层析是一种简便 快速 微量的层析方法 一般将吸附剂撒布到平面如玻璃片上 形成一薄层进行层析时 即称薄层层析 针对某些性质特殊的化合物的分离与检出 有时需采用一些特殊薄层 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 图1薄层色谱展开示意图 被分离混合物 组分一 组分二 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 吸附簿层色谱2 1固定相 吸附剂 的选择 正己烷环己烷四氯化碳甲苯氯仿正丁醇乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水 溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强 在一块薄层板上进行试验 若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿 此溶剂的极性过强 若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动 留在了原点上 此溶剂的极性过弱 理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大 各组分理想的比移值在0 2 0 8之间 当一种溶剂不能很好地展开各组分时 常选择用混合溶剂作为展开剂 先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物 若展开不好 用极性较大的溶剂与前一溶剂混合 调整极性 再次试验 直到选出合适的展开剂组合 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 吸附簿层色谱2 1流动相 展开剂 的选择 3薄层色谱操作 3 1薄层板的制备 吸附剂硅胶 玻璃板 调制时慢慢搅拌 勿使产生气泡 均匀涂布在玻璃板上 摇动摊平 晾干 使用前放入烘箱内 在105 115 左右烘干40 50min 冷却后使用 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3薄层色谱操作 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 2点样 样品溶液的配制 点样 3薄层色谱操作 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 1 2cm 图3展开示意图 展开剂要接触到吸附剂下沿 但切勿接触到样点 盖上盖子 展开 观察展开情况 取出薄层板 3薄层色谱操作3 3展开 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 上升法 倾斜上行法 下降法 图4展开方式示意图 画溶剂前沿线 观察斑点 记录Rf值 图5薄层色谱展开示意图 1h反应混合液样 原料样 结论 反应结束 3薄层色谱操作3 3显色 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 本身带有颜色 本身无颜色 含有荧光剂的薄层板 有色斑点 显色剂显色 暗色斑点 特殊薄层 荧光薄层 络合薄层 酸碱薄层和PH缓冲薄层 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 荧光薄层 有些化合物本身无色 在紫外灯下也不显荧光 又无适当的显色剂时 则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析 展层后置于紫外光下照射 薄层板本身显荧光 而样品斑点处不显荧光 即可检出样品的层析位置 常用的荧光物质多为无机物 其一是在254nm紫外光激发下显出荧光的 如锰激化的硅酸锌 另一种为在365nm紫外光激发下发出荧光的 如银激化的硫化锌 硫化镐 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 络合薄层 常用的有硝酸银薄层 用来分离碳原子数相等而其中C一C双键数目不等的一系列化合物 如不饱和醇 酸等 其主要机理是由于C C键能与硝酸银形成络合物 而饱和的C C键则不与硝酸银络合 因此在硝酸银薄层上 化合物可由于饱和程度不同而获得分离 层析时饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高 含一个双键的较含两个双键的Rf值高 含一个三键的较含一个双键的Rf值高 在一个双键化合物中 顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行 因此 还可用来分离顺反异构体 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 酸碱薄层和pH缓冲薄层 为了改变吸附剂原来的酸碱性 可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层 例如硅胶带微酸性 有时对碱性物质如生物碱的分离不好 如不能展层或拖尾 则可在铺薄层时 用稀碱溶液0 1 0 5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层 例如猪屎豆碱在以硅胶为吸附剂时 以氯仿 丙酮 甲醇 8 2 1 为展开剂Rf 0 1 采用碱性硅胶薄层用上述相同展开剂 Rf值增至0 4左右 说明猪屎豆碱为 碱性生物碱 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 薄层层析法应用 化学成分的预试 化学成分的鉴定 探索柱层分离的条件 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 化学成分的预试 用薄层层析法进行中草药化学成分预试 可依据各类成分性质及熟知的条件 有针对性地进行 由于在薄层上展层后 可将一些杂质分离 选择性高 可使预试结果更为可靠 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 化学成分的鉴定 以薄层层析法进中草药化学成分鉴定 最好要有标准样品进行共薄层层析 如用数种溶剂展层后 标准品和鉴定品的Rf值 斑点形状颜色都完全相同 则可作初步结论是同一化合物 但一般需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 探索柱层分离的条件 在进行柱层分离时 首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂 在洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱 每一洗脱液中是否为单一成分或混合体 均可由薄层的分离得到判断与检验 通过薄层的预分离 还可以了解多组分样品的组成与相对含量 如在薄层上摸索到比较满意的分离条件 即可将此条件用于干柱层析 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 制备薄层色谱 PTLC 一种是流动相靠毛细管作用力流经固定相 传统的制备型薄层薄层色谱 另一些方法是流动相靠外力强制流动 如离心薄层色谱和加压薄层色谱 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 制备薄层色谱 PTLC 吸附剂硅胶是最常用的吸附剂 上样量与吸附剂的厚度有关 上样上样是进行PTLC分离的一个最关键的步骤 上样前先用样品溶于少量溶剂 低挥发性溶剂可引起点样带变宽 因此最好选用挥发性溶剂 如己烷 二氯甲烷 乙酸乙酯等 样品浓度应在5 10 左右 点样带应尽可能狭窄 以获得更好的分离效果 点样可用手工进行或自动点样仪 展开剂的选择及展开在进行PTLC之前应用分析型TLC预试验来确定展开剂 被分离物质的回收 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 吸附柱色谱 柱层析 吸附剂的用量一般为样品量的30 60倍 样品极性较小 难以分离者 吸附剂用量可适当提高到样品量的100 200倍 据此可选择适当规格的色谱管 实验室中常用色谱管的规格如下所示 其高度与直径比 h d 约为 15 1 20 1 柱色谱用的硅胶及氧化铝通常以100 200目或200 300目为宜 或甚至直接采用薄层色谱用规格 其分离效果可以大大提高 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 4 吸附柱色谱 洗脱剂的选择 以TLC摸索洗脱条件装柱 湿法装柱 以起始洗脱剂拌匀装柱 或干法装柱 直接装 湿法装柱 用玻棒将少许脱脂棉放置于干净的色谱柱底部 轻轻塞紧 关闭活塞 向柱中倒入洗脱剂到约柱高的3 4处 打开活塞 控制流速约1滴 s 通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入吸附剂 用木棒轻轻敲打柱身下部 使其填装紧密 装至3 4时停止加吸附剂 待洗脱剂将干时 轻轻放少许脱脂棉到吸附剂的上方 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 4 吸附柱色谱 3 样品的预处理干法上样 能直接溶于洗脱剂的样品用适量洗脱剂溶解样品 尽可能少 以利样品在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带 湿法上样 不能溶解于洗脱剂的样品 则将用能使之溶解的溶剂溶解后 再用少量吸附剂拌匀 并减压抽干溶剂或在60 下加热挥尽溶剂 置真空干燥器中减压干燥或直接减压抽干 研粉后再小心铺在吸附剂柱上 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 4 洗脱用溶剂的极性宜逐步增加 跳跃不能太大 实践中多用混合溶剂 并通过巧妙调节比例以改变极性 达到梯度洗脱分离物质的目的 一般混合溶剂中强极性溶剂的影响比较突出 故不可随意将极性差别很大的两种溶剂组合在一起使用 实验室中最常应用的混合溶剂组合如下 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 4 吸附柱色谱 吸附柱色谱常用混合洗脱溶剂 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 4 吸附柱色谱 5 为避免发生化学吸附 酸性物质宜用硅胶 碱性物质则宜用氧化铝进行分离 硅胶 氧化铝用适当方法处理成中性时 情况会有所缓解 通常在分离酸性 或碱性 物质时 洗脱溶剂中分别加入适量醋酸 或氨 吡啶 二乙胺 常可收到防止拖尾 促进分离的效果 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 5 聚酰胺吸附色谱法 聚酰胺 poliamide 吸附属于氢键吸附 是一种用途十分广泛的分离方法 极性物质与非极性物质均可适用 但特别适合分离酚类 醌类 黄酮类化合物 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 1 聚酰胺的吸附原理 系通过分子中的酰胺羰基与酚类 黄酮类化合物的酚羟基 或酰胺键上的游离胺基与醌类 脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附 至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键的能力 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 聚酰胺的吸附原理 在含水溶剂中大致有以下规律 形成氢键的基团数目越多 则吸附能力越强 成键位置对吸附力也有影响 易形成分子内氢键者 其在聚酰胺上的吸附即相应减弱 分子中芳香化程度高者 则吸附性增强 反之 则减弱 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 聚酰胺的吸附原理 吸附因为是在溶液中进行 故溶剂也会参加吸附剂表面的争夺 或通过改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程 聚酰胺与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强 在含水醇中则随醇浓度的增高而相应减弱 在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合 故在聚酰胺柱色谱分离时 通常用水装柱 样品也尽可能作成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附 随后用不同浓度的含水醇洗脱 并不断提高醇的浓度 逐步增强从柱上洗脱物质的能力 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 聚酰胺的吸附原理 甲酰胺 二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基 作为第三者可以同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合 故有很强的洗脱能力 此外 水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合 也有较强的洗脱能力 可用于聚酰胺的精制及再生处理 常用的聚酰胺再生剂有10 醋酸 3 氨水及5 氢氧化钠水溶液等 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 聚酰胺的吸附原理 各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强 可大致排列成下列顺序 水 甲醇 丙酮 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 聚酰胺色谱的应用 聚酰胺对一般酚类 黄酮类化合物的吸附是可逆的 鞣质除外 分离效果好 加以吸附容量又大 故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离 对生物碱 萜类 甾体 糖类 氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有广泛的用途 因为对鞣质的吸附特强 近乎不可逆 故用于植物粗提取物的脱鞣质处理特别适宜 聚酰胺色谱也有薄层色谱和柱色谱两种方式 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 6 大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂 具有较好的吸附性能 它的吸附作用是通过表面吸附 表面电性或形成氢键 大孔树脂吸附分离技术是采用特殊的吸附剂 选择地吸附其中的有效成分 去除无效成分的一种提取精制的新工艺 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 大孔吸附树脂的性质 大孔吸附树脂多为白色的球状颗粒 粒度多为20 60目 通常分为非极性和极性两大类 根据极性大小还可分为弱极性 中等极性和强极性 常用的为苯乙烯型和丙烯腈型 在树脂合成时根据需要引入极性基团则成为极性树脂从而增强吸附能力 大孔吸附树脂的理化性质稳定 不溶于酸 碱及有机溶剂 对有机物的选择性较好 不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 大孔吸附树脂的分离原理 吸附性范德华引力或生成氢键的结果 筛选原理本身多孔性结构所决定 由于吸附和筛选原理 有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小 在大孔吸附脂上经一定的溶剂洗脱而分开 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 大孔吸附树脂分离条件的确立 1 树脂的选择首先 要根据被分离化合物的分子体积的大小通过预实验确定适当孔径的树脂 其次 要根据分子中是否含有酚羟基 羧基或碱性氮原子来确定树脂的型号和分离条件 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 2 洗脱液的选择对非极性大孔吸附树脂 洗脱剂极性越小 洗脱能力越强 对中等极性大孔树脂和极性较大的化合物来说 则用极性较大的洗脱剂为佳 根据吸附力强弱选用不同的洗脱剂及浓度 为达到满意的效果 可通过几种洗脱剂浓度的比较来确定最佳洗脱浓度 实际工作中甲醇 乙醇 丙酮应用较多 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 3 大孔吸附树脂分离条件的确立 4 大孔吸附树脂的处理 市售大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体 致孔剂 多为长碳链的脂肪醇类 分散剂和防腐剂等杂质 使用前必须经过处理 处理方法是 采用乙醇湿法装柱 随用乙醇在柱上作流动清洗 并不时检查流出的乙醇 直至流出的乙醇液与水混合不呈现白色乳浊现象即可 然后用大量蒸馏水洗去乙醇 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 样品一般用水溶液上柱 洗脱时根据吸附作用强弱不同选用不同浓度的甲醇 乙醇等含水溶剂 直至纯的甲醇 乙醇 乃至丙酮 乙酸乙酯等 对非极性大孔吸附树脂 洗脱溶剂极性越小 洗脱能力越强 对于中等极性的大孔吸附树脂和极性较大的化合物来说 则以用极性较大的溶剂为宜 4 大孔吸附树脂的处理 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 四根据物质分子大小差异进行分离 天然有机化合物分子大小各异 中药的化学成分非常复杂 通常含有无机盐 生物碱 氨基酸和有机酸 酚类 酮类 皂昔 甾族和萜类化合物以及蛋白质 多糖 粘液质 鞣质 淀粉 纤维素 无机盐等 相对分子质量的分布很宽 从几十到几百万道尔顿 故可据此进行分离 表1列出了部分中药所含主要成分的相对分子质量范围 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 四根据物质分子大小差异进行分离 一般来讲 高相对分子质量物质主要是胶体和纤维素等非药效成分或药效较低的成分 药物有效部位的相对分子质量一般较小 仅有几百到几千道尔顿 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 四根据物质分子大小差异进行分离 1 凝胶过滤法2 透析法3 超滤法4 超速离心法 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 1 凝胶过滤法 gelfiltration 凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱法 gelpermeationchromatography 分子筛过滤 molecularsievefiltration 排阻色谱 exclusionchromatography 利用分子筛分离物质的一种方法 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 凝胶过滤法分离原理 葡聚糖凝胶在水中膨胀成球形颗粒 具有三维空间的网状结构 由于凝胶网孔半径的限制 大分子将不能渗入凝胶颗粒内部 即被排阻在凝胶粒子外部 故在颗粒间隙移动 并随溶剂一起从柱底先行流出 小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部 故通过色谱柱阻阻力增大 流速边缓 将较晚流出 样品混合物中各个成分因分子大小各异 渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同 故在经历一段时间流动并达到动态平衡后 即按分子由大到小顺序先后流出并得到分离 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 凝胶的种类与性质 葡聚糖凝胶 Sephadex 羟丙基葡聚糖凝胶 SephadexLH 20 丙烯酰胺凝胶 Bio GelP 琼脂糖凝胶 SepharoseBio GelA 羧甲基交联葡聚糖凝胶 SP Sephadex 苯胺乙基交联葡聚糖凝胶 QAe Sephadex 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 葡聚糖凝胶 由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂交联聚合而成 凝胶颗粒网孔大小取决于交联剂的用量及反应条件 交联剂用量越多 即交联度越高 则网孔越紧密 孔径越小 吸水膨胀越小 交联度越低 则网孔越稀疏 孔径越大 吸水膨胀也越大 商品型号即按交联度大小分类 并以吸水量多少表示 以SephadexG 25为例 G为凝胶 Gel 后附数字 吸水量 10 故G 25示该葡聚糖凝胶吸水量为2 5ml g SephadexG型只适用于在水中应用 不同规格适合不同分子量的物质 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionandIsolation 羟丙基葡聚糖凝胶 为SephadexG经羟丙基化处理后得到的产物 其分子中的葡萄糖部分与羟丙基以醚键形式结合 与SephadexG比较 SephadexHL 20分子中 OH基总数虽无改变 但碳原子所占比例却相对增加 因此与SephadexG仅具亲水性不同 不仅可在水中应用 也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用 SephadexLH 20除保留有SephadexG 25原有的分子筛特性 可按分子量大小分离物质外 在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果 适用于不同类型有机化合物的分离 第四节提取分离方法 MethodsofExtractionan