重组蛋白纯化基本策略

重组蛋白纯化基本策略 捕获阶段 目标是澄清 浓缩和稳定目标蛋白 中度纯化阶段 目标是除去大多数大量 杂质 如其它蛋白 核酸 内毒素和病毒等 精制阶段 除去残余的痕量杂质和必须去除 的杂质 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法 蛋白质的性质 方法电荷 等电点 离子交换 IEX 分子量凝胶过滤 GF 疏水性疏水 HIC 反相 RPC 特异性结合亲和 AC 每一种方法都有分辨率 处理量 速度和回收率之间的平 衡 分辨率 由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现 总的来说 当杂质和目标 蛋白性质相似时 在纯化的最后阶段分辨率是重要因素 处理量 一般指在纯化过程中目 标蛋白的上样量 如上样体积 浓度等 速度 在初纯化中是重要因素 此时杂质如蛋白 酶必须尽快除去 回收率 随着纯化的进行渐趋重要 因为纯化产物的价值在增加 在 三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表 技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始 状态样品最终状态 IEX 高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或 pH 改 变 样品浓缩 HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩 AC 高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩 GF 高分辨率 使用 Supedex 样品体积 总柱体积的 5 和流速范围有限制缓冲液更换 如果需要 样品稀释 RPC 高分辨率 需要有机溶剂在有机溶剂中 有损失生物活性的风险 提示 1 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少 以避免需要调节样品 第一 个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件 2 硫酸铵沉淀是常用的样品 澄清和浓缩方法 所以 HIC 是捕获阶段的理想方法 3 GF 很适宜在由浓缩效应的方法 IEX HIC AC 后使用 凝胶过滤对上样体积有限制 但不受缓冲液条件的影响 4 在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或 和处理量的方法 5 如果对目标蛋白的 性质了解甚少的情况下 可采用 IEX HIC GF 的方法组合作为标准方案 6 只要目标蛋白 耐受的情况下 可以考虑采用 RPC 方法用于精制阶段 注 应该指出 三阶段纯化策略 不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤 所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终 用途 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要 蛋白质的一级 二级 三级和四级结构决定了它的物理 化学 生物化学 物理化学和摘要 蛋白质的一级 二级 三级和四级结构决定了它的物理 化学 生物化学 物理化学和 生物学性质 综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异 利用一种生物学性质 综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异 利用一种 同时多种性质差异 在兼顾收率和纯度的情况下 选择蛋白质提纯的方法 同时多种性质差异 在兼顾收率和纯度的情况下 选择蛋白质提纯的方法 关键词 蛋白质关键词 蛋白质 分离纯化分离纯化 前言 前言 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在 每种类型的细胞都含有成千种蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在 每种类型的细胞都含有成千种 不同的蛋白质 蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务 到目前为止 还没有一个不同的蛋白质 蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务 到目前为止 还没有一个 单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来 但对任何一种蛋白单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来 但对任何一种蛋白 质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品 质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品 蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性 对纯化的要求是以合理的效率 速度 蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性 对纯化的要求是以合理的效率 速度 收率和纯度 将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来 同时仍收率和纯度 将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来 同时仍 保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性 保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因 是不同的蛋白质在它们的许多能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因 是不同的蛋白质在它们的许多 物理 化学 物理化学和生物学性质有着极大的不同 这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列物理 化学 物理化学和生物学性质有着极大的不同 这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列 和数目不同造成的 连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的 荷负电的 极性的或非极性和数目不同造成的 连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的 荷负电的 极性的或非极性 的 亲水的或疏水的 此外多肽可折叠成非常确定的二级结构 的 亲水的或疏水的 此外多肽可折叠成非常确定的二级结构 螺旋 螺旋 折叠和各种转角 折叠和各种转角 三级结构和四级结构 形成独特的大小 形状和残基在蛋白质表面的分布状况 利用待分离的三级结构和四级结构 形成独特的大小 形状和残基在蛋白质表面的分布状况 利用待分离的 蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异 即能设计出一组合理的分级分离步骤 蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异 即能设计出一组合理的分级分离步骤 可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离 可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离 1 分子大小 分子大小 不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别 可用一些简便的方法 使蛋白质混合物不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别 可用一些简便的方法 使蛋白质混合物 得到初步分离 得到初步分离 1 1 透析和超滤透析和超滤 透析在纯化中极为常用 可除去盐类 脱盐及置换缓冲液 有机溶剂 低分子量的抑制透析在纯化中极为常用 可除去盐类 脱盐及置换缓冲液 有机溶剂 低分子量的抑制 剂等 透析膜的截留分子量为剂等 透析膜的截留分子量为 5000 左右 如分子量小于左右 如分子量小于 10000 的酶液就有泄露的危险 在纯化的酶液就有泄露的危险 在纯化 中极为常用 可除去盐类 有机溶剂 低分子量的抑制剂等 超滤一般用于浓缩和脱色中极为常用 可除去盐类 有机溶剂 低分子量的抑制剂等 超滤一般用于浓缩和脱色 1 2 离心分离置换缓冲液离心分离置换缓冲液 许多酶富集于某一细胞器内 匀浆后离心得得到某一亚细胞成分 使酶富集许多酶富集于某一细胞器内 匀浆后离心得得到某一亚细胞成分 使酶富集 10 20 倍 再倍 再 对特定的酶进行纯化 差速离心 分辨率较低 仅适用于粗提或浓缩 速率区带法 如离心时对特定的酶进行纯化 差速离心 分辨率较低 仅适用于粗提或浓缩 速率区带法 如离心时 间太长所有的物质都会沉淀下来 故需选择最佳分离时间 可得到相当纯的亚细胞成分用于进间太长所有的物质都会沉淀下来 故需选择最佳分离时间 可得到相当纯的亚细胞成分用于进 一步纯化 避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题 但容量较小 只能用于少量制备 等一步纯化 避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题 但容量较小 只能用于少量制备 等 密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖 聚蔗糖 氯化铯 溴化钾 碘化钠等等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖 聚蔗糖 氯化铯 溴化钾 碘化钠等等 1 3 凝胶过滤凝胶过滤 这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一 注意使要离的蛋白质分子量落在这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一 注意使要离的蛋白质分子量落在 凝胶的工作范围内 选择不同的分子量凝胶可用于脱盐 置换缓冲液及利用分子量的差异除去凝胶的工作范围内 选择不同的分子量凝胶可用于脱盐 置换缓冲液及利用分子量的差异除去 热源 热源 2 形状 形状 蛋白质在离心通过溶液运动时 或通过膜 凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时 蛋白质在离心通过溶液运动时 或通过膜 凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时 都会受到形状的影响 对两种相同质量的蛋白质而言 球状蛋白质具有较小的有效半径 斯托都会受到形状的影响 对两种相同质量的蛋白质而言 球状蛋白质具有较小的有效半径 斯托 克半径 通过溶液沉降时遇到的摩擦力小 沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大 反之 克半径 通过溶液沉降时遇到的摩擦力小 沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大 反之 在体积排阻色谱时 斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部 较在体积排阻色谱时 斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部 较 迟洗脱出来 因而显得比其它形状的蛋白质要小 迟洗脱出来 因而显得比其它形状的蛋白质要小 3 溶解度 溶解度 利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法 影响蛋白质溶解度的外界因素利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法 影响蛋白质溶解度的外界因素 很多 其中主要有 溶液的很多 其中主要有 溶液的 pH 离子强度 介电常数和温度 但在同一的特定外界条件下 离子强度 介电常数和温度 但在同一的特定外界条件下 不同的蛋白质具有不同的溶解度 适当改变外界条件 控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度不同的蛋白质具有不同的溶解度 适当改变外界条件 控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度 3 1pH 控制和等电点沉淀控制和等电点沉淀 蛋白质在其等电点一般较不易溶解 蛋白质在其等电点一般较不易溶解 3 2 蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 3 3 有机溶剂分级法有机溶剂分级法 蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同 从基本不溶 蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同 从基本不溶 10 g ml 直至极易溶解 直至极易溶解 300mg ml 不等 影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度 不等 影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度 pH 溶剂的极性 离子性质 溶剂的极性 离子性质 和离子强度 引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同 故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质 和离子强度 引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同 故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀 3 4 温度温度 不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性 大多数蛋白质在低温下比较稳定 不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性 大多数蛋白质在低温下比较稳定 故分离操作一般在故分离操作一般在 0 或更低温度下进行 或更低温度下进行 4 1 电泳电泳 不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段 而且也是研究蛋白质性质很有用不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段 而且也是研究蛋白质性质很有用 的方法 的方法 等电聚焦分辨率很高 等电聚焦分辨率很高 pI 有有 0 02pH 的差异就能分开 的差异就能分开 2D PAGE 分离蛋白质分辨率已经发展到分离蛋白质分辨率已经发展到 100000 个蛋白点 个蛋白点 4 2 离子交换层析离子交换层析 改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度 改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度 pH 和 阴 阳 离子交换填料 不同蛋白质对和 阴 阳 离子交换填料 不同蛋白质对 不同的离子交换填料的吸附容量不同 蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离 不同的离子交换填料的吸附容量不同 蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离 洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变 也可采用改变洗脱剂的盐度或洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变 也可采用改变洗脱剂的盐度或 pH 的方法洗脱 后的方法洗脱 后 一种可分分段洗脱和梯度洗脱 梯度洗脱一般效果好 分辨率高 特别是使用交换容量小 对一种可分分段洗脱和梯度洗脱 梯度洗脱一般效果好 分辨率高 特别是使用交换容量小 对 盐浓度敏感的离子交换剂 多用梯度洗脱 控制洗脱剂的体积 与柱床体体积相比 盐浓度盐浓度敏感的离子交换剂 多用梯度洗脱 控制洗脱剂的体积 与柱床体体积相比 盐浓度 和和 pH 样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来 样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来 蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同 故在一定的蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同 故在一定的 PH 值和离子强度的缓值和离子强度的缓 冲液的所带的电荷不同冲液的所带的电荷不同 5 电荷分布 电荷分布 电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面 既可以适当的强度与阳离子交换柱结合电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面 既可以适当的强度与阳离子交换柱结合 也能以适当强度与阴离子结合 因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的也能以适当强度与阴离子结合 因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的 离子交换柱结合 故可得用此性质纯化 电荷的氨基酸残基亦可成簇分布 使某一区域带强正离子交换柱结合 故可得用此性质纯化 电荷的氨基酸残基亦可成簇分布 使某一区域带强正 电荷而另一区域带强负电荷 呈强酸性或强碱性 只能在极端电荷而另一区域带强负电荷 呈强酸性或强碱性 只能在极端 pH 与阳离子交换树脂或阴离子与阳离子交换树脂或阴离子 交换树脂结合 如钙调蛋白只能在交换树脂结合 如钙调蛋白只能在 pH2 时与阳离子交换树脂结合 时与阳离子交换树脂结合 6 疏水性 疏水性 多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部 但也有一些在表面 蛋白质表面的疏水性氨基多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部 但也有一些在表面 蛋白质表面的疏水性氨基 酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的 能力 能力 因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性 是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具 高因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性 是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具 高 浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留 在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱 故特别适用于浓浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留 在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱 故特别适用于浓 硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上 硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上 当然也适用当然也适用 7mol 盐酸胍或盐酸胍或 8mol L 脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上 在分离脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上 在分离 的同时也进行了复性 的同时也进行了复性 7 密度 密度 多数蛋白质的密度在多数蛋白质的密度在 1 3 1 4g cm3 之间 分级分离蛋白质时一般不常用此性质 不过对含之间 分级分离蛋白质时一般不常用此性质 不过对含 有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同 可用密度梯度法离心与大部分有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同 可用密度梯度法离心与大部分 蛋白质分离 蛋白质分离 8 基因工程构建的纯化标记 基因工程构建的纯化标记 通过改变通过改变 cDNA 在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸 这个加入的在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸 这个加入的 标记可用来作为一个有效的纯化依据 标记可用来作为一个有效的纯化依据 8 1GST 融合载体融合载体 使要表达的蛋白质和谷胱甘肽使要表达的蛋白质和谷胱甘肽 S 转移酶一起表达 然后利用转移酶一起表达 然后利用 Glutathione Sepharose 4B 作作 亲和纯化 再利用凝血酶或因子亲和纯化 再利用凝血酶或因子 Xa 切开 切开 8 2 蛋白蛋白 A 融合载体融合载体 使要表达的蛋白和蛋白使要表达的蛋白和蛋白 A 的的 IgG 结合部位融合在一起表达 以结合部位融合在一起表达 以 IgG Sepharose 纯化 纯化 8 3 含组氨酸标记 含组氨酸标记 Histidine tagged Chelating Sepharose 最通行的标记之一 是在蛋白质的氨基端加上最通行的标记之一 是在蛋白质的氨基端加上 6 10 个组氨酸 在一般或变性条件 如个组氨酸 在一般或变性条件 如 8M 尿素 下借助它能与尿素 下借助它能与 Ni2 螯合柱紧紧结合的能力 用咪唑洗脱 或将螯合柱紧紧结合的能力 用咪唑洗脱 或将 pH 降至降至 5 9 使组氨酸充使组氨酸充 分质子化 不再与结合分质子化 不再与结合 Ni2 使之得以纯化 使之得以纯化 重组蛋白在设计 构建时已融入纯化构想 样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物 扩张床吸重组蛋白在设计 构建时已融入纯化构想 样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物 扩张床吸 附技术附技术 STREAMLINE 适合做粗分离适合做粗分离 9 亲和能力 亲和能力 结合效率高 分离速度快的特点 配基可是酶的底物 抑制剂 辅因子 特异性的抗体 结合效率高 分离速度快的特点 配基可是酶的底物 抑制剂 辅因子 特异性的抗体 吸附后可改变缓冲液的离子强度和吸附后可改变缓冲液的离子强度和 PH 的方法 洗脱下来 也可用更高浓度的同一配体溶的方法 洗脱下来 也可用更高浓度的同一配体溶 液或亲和力更强的配体溶液洗脱液或亲和力更强的配体溶液洗脱 亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的 亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的 依亲和选择性的高低分为 基团性亲和层析 固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力 如依亲和选择性的高低分为 基团性亲和层析 固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力 如 含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力 高选择性 专一性 亲和含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力 高选择性 专一性 亲和 层析 配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性 如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附 层析 配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性 如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附 亲和层析除特异性的吸附外 仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附亲和层析除特异性的吸附外 仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附 一些杂蛋白质 另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系 一些杂蛋白质 另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系 与超滤结合起来 将两者优点集中形成超滤亲和纯化 具有高分离效率和大规模工业化的与超滤结合起来 将两者优点集中形成超滤亲和纯化 具有高分离效率和大规模工业化的 优点 适用于初分离 优点 适用于初分离 按配基的不同可分为 按配基的不同可分为 1 金属螯合介质 金属螯合介质 过渡金属离子过渡金属离子 Cu2 Zn2 和 和 Ni 2 等以亚胺络合物的形式键合到因定相上 由于这些 等以亚胺络合物的形式键合到因定相上 由于这些 金属离子与色氨酸 组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键 从而形成了亚胺金属金属离子与色氨酸 组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键 从而形成了亚胺金属 蛋白螯合物 蛋白螯合物 使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附 螯合物的稳定性受单个组氨使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附 螯合物的稳定性受单个组氨 酸和半胱氨酸解离常数所控制 从而亦受流动相的酸和半胱氨酸解离常数所控制 从而亦受流动相的 pH 和温度的影响 控制条件可以使不同蛋和温度的影响 控制条件可以使不同蛋 白质相互分离 白质相互分离 2 小配体亲和介质 小配体亲和介质 配体有精氨酸 苯甲酰胺 钙调因子 明胶 肝素和赖氨酸等等 配体有精氨酸 苯甲酰胺 钙调因子 明胶 肝素和赖氨酸等等 3 抗体亲和介质 抗体亲和介质 即免疫亲和层析 配体有重组蛋白即免疫亲和层析 配体有重组蛋白 A 和重组蛋白和重组蛋白 G 但蛋白 但蛋白 A 比蛋白比蛋白 G 专一 蛋白专一 蛋白 G 能结合能结合 更多不同源的更多不同源的 IgG 4 颜料亲和介质 颜料亲和介质 染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外 还与洗脱缓冲液的种类 离染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外 还与洗脱缓冲液的种类 离 子强度 子强度 PH 值及待分离的样品的纯度有关 配体有值及待分离的样品的纯度有关 配体有 Cibacron Blue 和和 Procion Red 两种 在一两种 在一 定的条件下 固定化的染料能起阳离子交换剂的作用 为了避免此现象的发生 最好要离子强定的条件下 固定化的染料能起阳离子交换剂的作用 为了避免此现象的发生 最好要离子强 度小于度小于 0 1 和和 PH 大于大于 7 时操作 时操作 5 外源凝集素亲和介质 外源凝集素亲和介质 配体有刀豆球蛋白 扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素 固相外源凝集素能和数种糖类残配体有刀豆球蛋白 扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素 固相外源凝集素能和数种糖类残 基发生可逆反应 适合纯化多糖 糖蛋白 基发生可逆反应 适合纯化多糖 糖蛋白 10 非极性基团之间作用力 非极性基团之间作用力 溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力 非选择性分散力或伦敦力 大溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力 非选择性分散力或伦敦力 大 小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离 因其小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离 因其 流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂 如甲醇 乙腈 四氢呋喃等 这些有机溶剂可流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂 如甲醇 乙腈 四氢呋喃等 这些有机溶剂可 能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性 流动相中须有离子对试剂 如三氟乙酸 甲酸 磷酸能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性 流动相中须有离子对试剂 如三氟乙酸 甲酸 磷酸 等 存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率 分离须在酸性介质中进行 一般等 存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率 分离须在酸性介质中进行 一般 pH 在在 2 3 之间 又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化 故在生物大分之间 又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化 故在生物大分 子中人分离纯化中受到限制 但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法 子中人分离纯化中受到限制 但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法 正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少 因所用的溶剂很贵 正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少 因所用的溶剂很贵 11 可逆性缔合 可逆性缔合 在某些溶液条件下 有一些酶能聚合成二聚体 四聚体等 而在另一种条件下则形成单体 在某些溶液条件下 有一些酶能聚合成二聚体 四聚体等 而在另一种条件下则形成单体 如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离 如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离 12 稳定性 稳定性 12 1 热稳定性热稳定性 大多数蛋白质加热到大多数蛋白质加热到 95 时会解折叠或沉淀 利用这一性质 可容易地将一种经这样加热时会解折叠或沉淀 利用这一性质 可容易地将一种经这样加热 后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开 后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开 12 2 蛋白酶解稳定性蛋白酶解稳定性 用蛋白酶处理上清液 消化杂蛋白 留下抗蛋白酶解抗性蛋白质 用蛋白酶处理上清液 消化杂蛋白 留下抗蛋白酶解抗性蛋白质 13 分配系数 分配系数 即利用双水相萃取分离 常用的生物物质分离体系有 聚乙二醇 即利用双水相萃取分离 常用的生物物质分离体系有 聚乙二醇 PEG 葡聚糖葡聚糖 DEXTRAN PEG 磷酸盐 磷酸盐 PEG 硫酸铵等 由于具有含水比例高 选用的聚合物及盐对硫酸铵等 由于具有含水比例高 选用的聚合物及盐对 酶无毒性 分离设备与化学工业通用等优点 在工业上目益受重视 酶无毒性 分离设备与化学工业通用等优点 在工业上目益受重视 分配行为受聚合物分子大小 成相浓度 分配行为受聚合物分子大小 成相浓度 PH 无机盐种类等因素影响 无机盐种类等因素影响 发展 具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术 发展 具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术 双向水溶液系统的蛋白质纯化双向水溶液系统的蛋白质纯化 一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液 液分配技术 可以液分配技术 可以 由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐 用于从微生物匀浆中除支细胞碎片 后由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐 用于从微生物匀浆中除支细胞碎片 后 续分配步骤进一步纯化 分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加 续分配步骤进一步纯化 分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加 14 表面活性 表面活性 14 1 泡沫分离泡沫分离 蛋白质溶液具有表面活性 气体在溶液中鼓泡 气泡与液相主体分离 在塔顶富集 达到蛋白质溶液具有表面活性 气体在溶液中鼓泡 气泡与液相主体分离 在塔顶富集 达到 分离和浓缩的目的 分离和浓缩的目的