农杆菌介导法

实验九实验九 植物遗传转化植物遗传转化 农杆菌介导法农杆菌介导法 一 目的一 目的 了解农杆菌转化的机理 掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二 原理二 原理 根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 具有跨界转移DNA的能力 下列因子与转化 过程有关 1 Ti 质粒质粒 tumor inducing plasmid 上的上的T DNA transferred DNA T DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列 T DNA含有RB和 LB两个边界 它们是25bp的正向重复序列 是T DNA 转移的顺式作用元件 不同类型的 农杆菌其边界序列有所不同 但划线部分为完全保守序列 置于该边界内的任何外源基因 均可被转化 LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤 但RB缺失会导致致瘤能力丧失 这时几乎 完全没有T DNA的转移 LB 链 5 GTTTACACCACAATATATCCTGCCA 3 RB 链 5 TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC 3 2 Ti质粒上的质粒上的Vir区 区 virulence region 操纵子 操纵子 转化所必需的基因有virA B C D E G 其中蛋白VirD1 D2识别T DNA边界RB 和LB VirC识别T DNA右边界的超驱增强子 VirD2在T DNA底链起内切酶作用造成切刻 并与T 链 5 共价结合 带有1个核定位信号NLS VirB形成转移复合通道 VirE2为单链 DNA结合蛋白 有2个NLS 该操纵子的表达顺序如下 virA和virG组成型表达形成VirA和VirG蛋白 VirA被植物创伤信号分子激活 激活的 VirA使VirG激活 激活的VirG 诱导virC D E B F H表达 3 农杆菌染色体基因组相关基因 农杆菌染色体基因组相关基因 chvA chvB 农杆菌运动 附着 chvD chvE 编码 单糖结合蛋白 趋化性 pscA att cel 合成纤维素丝 附着 它们与农杆菌的趋化性 和识别附着植物细胞有关 4 寄主细胞表面受体寄主细胞表面受体5 诱导条件诱导条件 小分子酚类化合物小分子酚类化合物 如乙酰丁香酮 AS acetosyringone 羟基乙酰丁香酮 OH AS hydroxyacetosyringone 它们是植物细胞创伤反应的一部分 或创伤细胞合成木质素 的一部分 是莽草酸合成途径的产物 植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生 AS及及OH AS 农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性 同时高浓度的AS又可使农杆 菌的vir基因活化表达 这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体 通常不存在于单子叶 植物中 这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物 若要实现农杆菌对水稻的转 化 必须添加这类诱导物 糖类糖类 如D 葡萄糖 D 木糖等 它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用 高浓度的肌醇高浓度的肌醇可促进vir基因的表达 低低pH pH 5 1 5 8 时Vir区基因的诱导达到最高水平 合适的温度合适的温度 25 28 virD及virG的活化必须低于28 农杆菌转化的关键步骤包括 农杆菌转化的关键步骤包括 农杆菌识别并定殖于植物细胞 植物受伤信号分子诱导农杆菌vir基因表达 T链形成 T复合体及毒性因子输入寄主胞质 T链进入寄主细胞核 T链整合至寄主基因组 T DNA基因表达 转化成功与否 转化效率的高低 除了与上述因素有关外 还与植物材料本身的状态 有关 一般要选择活力高 细胞分裂旺盛的材料作为转化受体 就水稻而言 授粉后 12 15d的幼胚 幼胚及成熟胚来源的胚性愈伤组织均是很好的受体材料 三 实验材料三 实验材料 水稻幼胚或胚性愈伤组织 含目的基因质粒的农杆菌 带有潮霉素抗性筛选基因hpt 无菌滤纸 四 仪器设备及用具四 仪器设备及用具 一 仪器设备 一 仪器设备 超净工作台 恒温摇床 培养箱 台式高速离心机 涡旋仪 抽滤器 高压灭菌锅 电子天平 酸度计 培养室 二 用具 二 用具 微量移液器 金属药匙 牙科手术钩或细菌涂布器 100mL无菌三角瓶 直径9cm培 养皿 200 L及1mL tip枪头 枪形镊 五 试剂及培养基五 试剂及培养基 一 试剂 一 试剂 二甲基亚砜 DMSO 乙酰丁香酮 AS 头孢霉素 Cefazollin sodium 羧苄青 霉素 Carbenicillin sodium 潮霉素 Hygromycin 卡那霉素 Kanamycin 链霉 素 Streptomycin 二 培养基 二 培养基 1 水稻愈伤组织培养基水稻愈伤组织培养基 N6macro B5micro B5vit 2 4 D 2 mg L CH 300 mg L L proline 500 mg L L glutamine 500 mg L sucrose 30g L agar 7 5g L pH5 8 2 筛选培养基筛选培养基 N6macro B5micro B5vit 2 4 D 2 mg L CH 300 mg L L proline 500 mg L L glutamine 500 mg L sucrose 30g L agar 7 5g L Hm 50 mg L cefa 250 mg L carb 250 mg L pH5 8 注 cef carb Hm等抗生素不能高压灭菌 应事先配成1000倍母液 抽滤除菌后冻 存 培养基灭菌后冷却至约70 在超净工作台内各加入1 1000 V上述三种抗 生素母液 摇匀 分装为25mL 皿 半开皿盖让平板冷却凝固后封皿 4 保 存 3 农杆菌农杆菌YM培养基培养基 单位单位 g L KH2PO4 0 5 NaCl 0 2 MgSO4 7H2O 0 2 Mannitol 10 L Glutamine 2 Yeast extract 0 3 Agar 15 Km50 mg L Sm50 mg L pH 7 0 抗生素Km和Sm不能高压灭 菌 农杆菌培养基中加入何种抗生素要视农杆菌菌株和所含工程质粒带何种筛选标 记基因而定 4 农杆菌悬浮液农杆菌悬浮液 MSmacro B5micro B5vit 2 4 D 2 mg L CH 500 mg L inositol 2g L sucrose 30g L AS 100 mol L pH5 5 5 共培养基共培养基 MSmacro B5micro B5vit 2 4 D 2 mg L CH 500 mg L inositol 2g L sucrose 30g L AS 100 mol L agar 7 5g L pH5 5 六 实验步骤六 实验步骤 1 农杆菌活化农杆菌活化 取保存于 70 的农杆菌菌种 涂布于YM培养基平板 27 28 培养2 3d 再取该 平板长出的菌落涂布于新的YM平板 27 28 培养2 3d 此时的农杆菌可用于转化 2 愈伤组织预培养愈伤组织预培养 在转化前4 5d 挑取色泽新鲜 淡黄色 颗粒状的愈伤组织继代于水稻培养基 25 暗培养 2皿 人 50块 皿 3 农杆菌侵染农杆菌侵染 用药匙将农杆菌从平板上刮出 接入农杆菌悬浮液 充分搅匀 置于摇床上 25 100rpm摇菌约1h 将愈伤组织 2 3mm大小 50块 投入菌液感染20min 取出置于滤纸吸干表面水分 全部接入1皿共培养基 共培养基表面事先放一张灭菌滤纸事先放一张灭菌滤纸 愈伤组织均匀摆放在滤