病毒滴度测定

1 3 可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度 第一个 Ep 管中加入 10uL 病毒原液 记为 1E 1 uL 第二个 Ep 管中进行了第一次十倍稀释 所得病毒原液为第一个 Ep 中的 1 10 记为 1E 0 uL 第三个 Ep 管中进行了第二次十倍稀释 所得病毒原液为第二个 Ep 中的 1 10 记为 1E 1 uL 依次类推 第七个 Ep 管中进行了第六次十倍稀释 所得病毒原液为第六个 Ep 中的 1 10 记为 1E 5 uL 第八个 Ep 管中进行了第七次十倍稀释 所得病毒原液为第七个 Ep 中的 1 10 记为 1E 6 uL 换句话说 如果在加入 1E 5 uL 病毒原液的孔中观察到 3 个带有荧光的细胞 说明该孔中至少有 3 个病 毒颗粒感染了细胞 则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量 本例子中就是 3 1E 5 3E 5 单位为 TU uL 也就等于 3E 8 TU mL 稀释计数法 滴度单位 TU mL 指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数 TU 为 transducing units 的 缩写 中文为 转导单位 表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数 第一天 细胞准备 将生长状态良好的 293 T 细胞消化计数后稀释至 1 100 000 mL 加入 96 孔板 100 L 孔 为每个 病毒准备 10 个孔 放入 37 5 二氧化碳培养箱中培养 第二天 加病毒 在 EP 管中做 10 倍梯度稀释 连续 10 个稀释度 稀释方法如下 每种病毒准备 10 个 1 5mL EP 管 每管加入 90 L 培养液 往第一个管中加入 10 L 病毒原液 混匀后 吸取 10 L 加入第二个管混匀 依此类推 做十个稀释度 10 0 00000001 吸取 96 孔板中原有的培养基 加入含稀释好的病毒液 并做好标记 第三天 追加培养液 在每个孔再加入 100 L 完全培养液 利于细胞的生长 第四天 观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果 并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数 假设为 X 和 Y 则滴度 TU mL X Y 10 1000 2 X 孔的病毒液的含量 L 定量 PCR 法 病毒感染 1 天前 取 6 孔板接种 HOS 细胞 每孔细胞为 5 100 000 个 接种细胞 24 小时后 取两个孔的细胞用血球计数板计数 确定感染时细胞的实际数目 记为 N 弃去其他培养板中的培养基 更换为含有 5 g mL polybrene 的新鲜培养基 将浓缩病毒用培养基稀 释 200 倍 也就是取 1 L 病毒加入到 199 L 的培养基中 在 3 个培养孔中分别加入 0 5 L 5 L 和 50 L 的稀释病毒 感染开始后 20 小时 除去培养上清 换为 500 L 含 DNaseI 的新鲜培养基 在 37 消化 15 分 钟 这一步是要除去残余的质粒 DNA 然后换为 2 mL 正常的培养基 继续培养 48 小时 用 0 5 mL 0 25 胰酶 EDTA 溶液消化细胞 在 37 放置 1 分钟 用培养基吹洗下 离心收集细胞 按照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA 每个样品管中加入 200 L 洗脱液洗下 DNA 用 DNA 定量试剂盒定量 Bio Rad 基因组 DNA 可以稳定保存在 20 至少两个月 准备 PCR 所需的试剂和样品 为病毒序列检测引物配总管 Forward primer 100 pmol mL 0 1 L n Reverse primer 100 pmol mL 0 1 L n Probe 100 pmol mL 0 1 L n 水 19 7 L n n number of reactions 例如 总反应数为 40 将 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master 2 3 Mix 4 L forward primer 4 L reverse primer 4 L probe 和 788 L 水混和 震荡后放在冰上 2 TaqMan Master Mix 25 L n 10 RNaseP primer probe mix 2 5 L n 水 17 5 L n n number of reactions 例如 总反应数为 40 将 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master Mix 100 L 10 RNaseP primer probe mix 和 700 L 水混和 震荡后放在冰上 在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立 从总管 中各取 45 L 加入到 A D 各行的孔中 从总管 中各取 45 L 加入到 E G 各行的孔中 分别取 5 L 质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A D 行中 每个样品重复 1 次 另留 1 个孔 加入 5 L 的水做为无模板对照 no template control 分别取 5 L 基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E G 行中 每个样品重复 1 次 另留 1 个孔加入 5 L 的水做为无模板对照 no template control 所使用定量 PCR 仪为 ABI PRISM 7000 定量系统 循环条件设定为 50 2 分钟 95 10 分钟 然后是 95 15 秒 60 1 分钟的 40 个循环 数据分析 测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定 得到每基因组整合的病 毒拷贝数 滴度 integration units per mL IU mL 的计算公式如下 IU mL C N D 1000 V 其中 C 平均每基因组整合的病毒拷贝数 N 感染时细胞的数目 约为 1 100000 D 病毒载 体的稀释倍数 V 加入的稀释病毒的体积数 96 孔板病毒滴定实验方法总结一 看了前面一个关于病毒滴定方法的帖子 自己也做过不少次 所以想写出一点儿 算是个总结 希望能对各位有 所帮助 这里我写 2 种方法 一种是在稀释好的病毒液里加细胞悬液 另一种是在长成单层的细胞上 加入已经 稀释好的病毒液 这两种方法我都做过 效果各有长处 1 一个确定的地方是 所用细胞是贴壁生长 所以在维持液或者生长液中都不能加入胰酶 这一点和流感病毒 病毒滴定测定有很大不同 2 稀释液配方 MEM 或 DMEM 1 双抗 NaHCO3 加入量由所需要 pH 值确定 一般以加到 pH7 0 为主 可用 pH 试纸测定 NaHCO3 的浓度为 6 另 MEM 或 DMEM 的选择由所培养的宿主细胞决定 3 细胞悬液为细胞 生长液 MEM 10 小牛血清 3 谷氨酰胺 1 双抗 NaHCO3 在加细胞悬液的病 毒滴定测定方法中 如果不加入细胞生长液 则细胞无法贴壁 方法一 在稀释好的病毒液中加入细胞悬液 1 一个确定的地方是 所用细胞是贴壁生长 所以在维持液或者生长液中都不能加入姨酶 这一天和流感病毒 病毒滴定测定有很大不同 2 稀释液配方 MEM 或 DMEM 1 双抗 NaHCO3 加入量由所需要 pH 值确定 一般以加到 pH7 0 为主 可用 pH 试纸测定 NaHCO3 的浓度为 6 另 MEM 或 DMEM 的选择由所培养的宿主细胞决定 3 细胞悬液为细胞 生长液 MEM 10 小牛血清 3 谷氨酰胺 1 双抗 NaHCO3 加细胞悬液的病毒滴定测定方法中 如果不加入细胞生长液 则细胞无法贴壁 4 96 孔板上做 10 倍稀释病毒 从 10 1 开始 一般做 5 6 个稀释度 即到 10 5 或 10 6 即可 每孔 25 微升 每 个稀释度做 4 孔 或者 8 孔 一般做 4 孔即可 3 3 5 消化细胞 并用生长液反复吹打细胞 使细胞充分混允 放入双碟 用排枪将细胞悬液加入相应孔中 每孔 100 微升 6 细胞对照孔 125 微升细胞悬液 不加病毒 7 关于 96 孔板 每孔接种的细胞量 一般在此种测定病毒滴度的方法下 要将细胞密度适当调低 至少要比正 常传代时低一些 否则细胞生长速度过快 未到 7 天则细胞出现死亡 对观察 CPE 不利 一般情况下 小塑料瓶 8 9ml 液体为正常用量 培养长慢单层后 消化细胞 加入 6ml 培养液 吹匀 吸出其中的 2ml 到另外的瓶子 在该瓶中加入 14 16ml 即可 如果不放心 可以用显微镜看一下 细胞数过多则补加培养液 少则补加剩余 4ml 的细胞悬液 8 37oC 5 CO2 培养 7 天左右 每天观察结果 从出现 CPE 的第一天开始记录 一般第 7 天可以计算病毒滴 度 9 计算公式 比较复杂 明天再附上 这里介绍一个简单的计算 TCID50 的方法 由以上公式求得 0 6 加到僅高於 50 感染率稀釋指數 此例中為 10 3 得 10 3 6 即為病毒作 10 3 6 稀釋後每 0 1ml 含 1 TCIP50 亦即該病毒之力價為 10 3 6 0 1ml 这里是以每个稀释度 8 孔为例 如果做的是 4 孔一个稀释度 则对应的换一下数字 即可 这里是转自别人的帖子 但是我用了之后觉得比那个很长的公式容易得多 所以推荐给大家 10 本方法的优点 不容易污染 缺点 细胞生长周期长 出结果所需时间也长 一般要到第 7 天才能计算病毒滴度 病毒本身有毒性 所以对细胞的贴壁造成一定影响 这也是此法中细胞生长慢的原因之一 不容易控制细胞数量 需要经验 一旦细胞数量过多 则不到第 7 天细胞大量死亡 无法判断 CPE 若细胞数 量过少 则细胞无法正常生长 不能正常增殖 也是造成无法判断 CPE 的原因之一 还有另外一种方法 明天再写 如果有什么不恰当的地方 希望有经验的高手多多 指教 希望大家能多多交流 谢谢 4 维持液 即病毒培养液 配方为 MEM 2 小牛血清 3 谷氨酰胺 1 双抗 NaHCO3 MEM 3 谷氨酰胺 1