酵母双杂总结

酵母双酵母双杂杂原理 原理 酵母双杂交系统由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因转录调控中建立 典型 的真核生长转录因子 如 GAL4 GCN4 等都含有二个不同的结构域 DNA 结合结构域 DNA binding domain 和转录激活结构域 transcription activating domain 前者可识别 DNA 上的特异序列 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用 启动它所调节的基因的转录 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开 仍具有各自的功能 而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白 蛋白的相互作用 主要有二类 载体 a 含 DNA binding domain 的载体 b 含 DNA activating domain 的载体 上述二类载体在构建融 合基因时 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合 融合基因在报告株中表达 其表达产 物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录 例如 GAL4 bd 具有核定位序列 nuclear localization sequence 而 GAL4 ad 没有 因此 在 GAL4 ad 氨基端或羧基端应克隆来自 SV40 的 T 抗原的一 段序列作为核定位的序列 目前研究中常用 binding domain 基因有 GAL4 1 147 LexA E coli 转录 抑制因子 的 DNA bd 编码序列 常用的 activating domain 基因有 GAL4 768 881 和疱疹病毒 VP16 的编码序列等 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株 报道株指经改造的 含报道基因 reporter gene 的重组 质粒的宿主细胞 最常用的是酵母细胞 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点 1 易于转化 便于回收扩增质粒 2 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因 3 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物 mammal mammalian 的蛋白结合 一般编码一个蛋白的基因 融合到明确的转录调控因子的 DNA 结合结构域 如 GAL4 bd LexA bd 另一个基因融合到转录 激活结构域 如 GAL4 ad VP16 激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系 中 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达 如 lacZ 从而可分析蛋白间的结合 作用 酵母双酵母双杂杂交文交文库库构建基本构建基本实验实验流程流程 一一 第一第一链链 cDNA 合成合成 1 准备高质量的 Poly A 或总 RNA 2 在微量离心管中混匀以下试剂 RNA 样本 0 025 1 0 g poly A 或 0 10 2 0 g 总 RNA 1 2 l 1 0 l CDS III 1 2 l 去离子水补齐体系到 4 0 l 注 对照实验时 请使用 1 g 的对照 RNA CDSIII Oligo dT CDSIII 6 随机引物 3 72 C 孵育 2 min 4 冰上冷却 2 min 然后 14000rpm 10s 瞬时离心 5 混合以下试剂 将混合液加入 Step4 中的经过变性且结合有引物的 RNA 样本中 轻拍混匀 5X First Strand 缓冲液2 0 l DTT 100 mM 1 0 l dNTP 混合物 10 mM 1 0 l SMART MMLV 反转录酶1 0 l 6 42 C 孵育 10 min 7 加入 1 l SMART III modified oligo 混匀 42 C 孵育 1 h 8 75 C 10 min 终止第一链合成反应 9 室温冷却 加入 1 l RNA 酶 H 2U 10 37 C 孵育 20 min 11 继续进行 LD PCR 扩增 二二 第二第二链链 cDNA 合成 合成 LD PCR 1 建立两管 100ul 的扩增体系 一个是实验组 另一个是对照组 往实验组离心管中加入以下试剂并混 合 第一链 cDNA2 l 蒸馏水70 l 10X Advantage 2 PCR 缓冲液10 l 50X dNTP 混合物2 l 5 PCR 引物2 l 3 PCR 引物2 l 10X 溶解液10 l 50X Advantage 2 聚合酶混合物2 l 总体积100 l 2 扩增程序 95 C30 sec x Cycles 95 C 10s 68 C 6 min 68 C5min 3 对每个样品取 7 l PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 三三 CHROMA SPIN TE 400 纯纯化柱化柱纯纯化化 ds cDNA 1 将剩余的 93ul 的 cDNA 样品加入 CHROMA SPIN TE 400 纯化柱中 颠倒纯化柱数次 重悬胶基质 直至均匀 移除顶端帽子 掰断柱底部的 break away 将柱放置在 2ml 的收集管中 2 700 rpm 5 min 离心 丢弃收集管和平衡液 之后让 matrix 半干 3 将将离心柱放在另第二个收集管中 然后 向胶基质平坦的表面上方加入 93ul 的样本 4 700 rpm 5 min 离心 样本便流到了收集管中 5 将两次的纯化样本收集到一个离心管中 并用乙醇进行沉淀 cDNA 加入 1 10 体积的 3 M 醋酸钠 加入 2 5 倍体积的冰乙醇 95 100 20 C 1 hr 放置沉淀 14 000 室温离心 20 min 弃上清 14 000 rpm 瞬时离心 去除残留的上清液 空气干燥 10 min 6 20 l 去离子水重悬 cDNA 用于酵母文库构建 四四 建立建立 Mate Plate 文文库库 1 遵循酵母转化系统文库规模酵母转化操作 向 0 5ml Y187 感受态中共转化下列组份 已纯化的 ds cDNA2 5 g pGADT7 Rec 0 5 g l 6 l 2 按照转化操作的第二步 将酵母重悬于 15ml 0 9 w v NaCl 中 3 将 100 l 的 1 10 1 100 稀释液分别铺板于 SD Leu 100 mm 固体培养基上 30 C 孵育 3 4d 确 定文库的库容 4 将剩下的悬浮液铺板于 150 mm SD Leu 选择培养基上 每板 100 l 悬浮液 约使用 150 板 30 C 孵育 3 4d 5 收获 Step4 中的转化子 a 4 C 3 4 h 冷却培养板 b 加入 5 ml 的冻存液 YPDA 25 甘油 c 使用无菌的玻璃珠分离菌落 缓缓地摇晃培养板 玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落 分离后的菌落溶于冻融液中 d 将所有的液体收集于无菌的单管中 收集后的体积要达到 0 5 L e 用血球计数板来计算细胞密度 若细胞密度小于1 5 50ml150ml 4 将上述酵母细胞液离心后转接到新的 YPDA 液体培养基中 使 OD600 0 2 30 C 200rpm 培养 4 6h 使 OD600 0 5 1 0 300ml1L 5 700g 离心 5 分钟收集酵母细胞 用无菌水或 TE 洗酵母细胞 25 50ml500ml 6 再次 700g 离心 5 分钟 7 弃上清 用 1 1 TE LiAc 重悬酵母细胞 1 5ml8ml 8 往离心管里加入如下试剂及 DNA DNA BD baita AD library Herring testes carrier DNA 0 1 g 0 1 g 0 1 mg 0 2 1 0 mg 0 1 0 5 mg 20 mg 9 加入感受态细胞 吸打均匀0 1 ml8 ml 10 加入 PEG LiAc 缓冲液 高速漩涡混合0 6 ml60 ml 11 200rpm 30 度孵育 30min 12 加入 DMSO 轻轻混合70 l7 0 ml 13 42 度 40min 水浴 14 冰浴 1 2min 15 室温高速离心 14000g 5s5min 16 弃上清 用 1 TE 重悬 进行涂皿操作0 5ml10ml 酵母文库的筛选酵母文库的筛选 A 诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测 1 诱饵载体和对照空载体转化酵母Y2H细胞 取100 L涂布SD Trp固体培养板 30 C倒 置培养3 4天待菌落长出 2 挑 2 3 mm 单克隆至 50 ml SD Trp 液体培养基中 30 C 摇床 230 260 rpm 16 24 hr 后 菌 落 PCR 检测目的基因是否转入 Y2H 中 70 C 保存阳性菌种 3 将阳性克隆在 SD Trp X gal SDO X SD Trp X gal Aba SDO X A 平板上划线 30 C 倒置培养 2 天 4 观察有无蓝色菌斑的出现 菌斑不显蓝色则表明无自我激活活性 若实验菌斑与对照 生长状况相同 则诱饵载体对酵母无毒 注 所需涂的皿及其生长结果如下表 sampleSelective agar plate2mm colonycolour Y2H pGBKT7 bait SDO SD Trp Yeswhite Y2H pGBKT7 bait SDO X GalYeswhite Y2H pGBKT7 bait SDO X Gal AbaNOno Y2H pGBKT7 Lam Y187 pGADT7 T DDO X Gal AbaNONO Y2H pGBKT7 53 Y187 pGADT7 T DDO X Gal AbaYesblue B 结合实验及筛库结合实验及筛库 1 在冰上冻融 1ml 文库 酵母菌株 2 x 107cells Y187 文库 2 在 2L 三角瓶中 加入 5ml 含 Y2H 酵母菌 1 x 109cells ml 目的蛋白 bait 的培养 基和上述冻融的 1ml 文库 3 加入 45ml 2 YPDA Kan 50 g ml 30 50rpm 30 mating 20 24 小时 mating 20 小时后可取 5 l 到显微镜下观察 如还没有结合子存在 再 mating 4 小时 否则 停止 mating 进入下面操作 4 准备SD Ade His Leu Trp QDO 培养基平板 约150个 涂皿前应在超净工 作台上吹2 3小时 5 转移 mating 体系至 2 个 50ml 离心管中 1000g 室温离心 10 分钟 弃上清液 然后 再加入 2 YPDA 洗一次酵母细胞 1000g 室温离心 10 分钟 弃上清液 再用灭菌水 清洗酵母细胞 两管合并 1000g 室温离心 10 分钟 弃上清液 加入约 10 ml 灭菌 水重悬酵母细胞 6 涂皿 每平板加入 150 l 上述悬浮酵母细胞用玻璃珠涂开至无流动液体 7 封皿后置于 30 恒温生长箱 生长 4 6 天后 选取菌斑大于 2mm 的菌落 在 QDO 平板皿上划线 2 3d 后长出的菌落可挑出来做插入片段扩增 PCR 8 将 7 中扩增片段大小不同 PCR验证3次 可大大降低假阳性菌落 约40 的 菌落于QDO QDO X Gal和QDO X Gal Aba培养基上划线 可适当增大X Gal和Aba 的浓度 以提高筛选的严谨性 封皿后置于30 恒温生长箱 生长2 3d后观察生长 状况 若在QDO上生长 QDO X Gal菌落变蓝 QDO X Gal Aba不生长 则存在互 作 将存在互作的菌落进行菌落PCR 将PCR产物送去测序 对测序结果进行分析 看是否存在与花粉的发育 能量传递和合成 核酸结合或者剪切 毒性蛋白等相关的 基因 9 挑互作酵母菌株至2ml 2 YPDA中 30 C摇床230 260 rpm 16 24 hr 提取酵母质 粒 再转入大肠杆菌中扩增含目的基因的载体 测序 到数据库中比对测序结果 标 记感兴趣的互作蛋白 10 阳性克隆验证 抽出互作的酵母质粒后做点对点验证 注意