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神经生物学绪论 NEUROBIOLOGYINTRODUCTION 刘宁 5 1 1概念与任务在分子 细胞 组织器官和整体等多个水平上研究神经系统的形态和功能的学科 6 任务 研究神经系统内分子水平 细胞水平和系统水平的变化过程 以及这些过程的整合作用 直至最复杂的高级功能 如学习 记忆等 目的 了解人类神经系统的结构和功能 以及行为与心理活动的物质基础 阐明行为和心理活动的神经机制 为改善人类感觉与运动效率 提高对神经系统疾病的防治水平以及增进健康服务 7 内容 神经解剖 生理 药理 病理 生物化学和细胞生物学及分子生物学等跨学科的基本理论研究 特点 1 包罗了基础神经科学的诸多学科2 并非若干传统学科简单和机械地组合3 在传统神经科学的基础之上成长和发展起来的一门新兴的综合性的边缘学科 8 主要研究领域 神经生物化学 neurobiochemistry 神经生理学 neurophysiology 细胞神经生物学 cellularneurobiology 分子神经生物学 molecularneurobiology 发育神经生物学 developmentalneurobiology 比较神经生物学 comparativeneurobiology 系统神经生物学 systematicneurobiology 9 人类对自身学习记忆思维等能力的探索了解脑是怎样工作对整个生物科学的激励作用对唯心主义哲学的挑战更清楚的了解人类自身 提高人的素质 缓解人类矛盾 为什么要重视神经生物学 10 1 2神经生物学发展和展望 22 神经系统结构研究19世纪80年代Cajal建立起神经元理论19世纪末和20世纪初 Sherrington关于 反射 突触 神经传递 的概念20世纪20到50年代通过高倍电镜对突触结构细节的观察 PicturesofSpanishanatomistRamonyCajal 26 FirstpageofSherrington sfamousbook TheIntegrativeActionoftheNervousSystem 1906 thisisthe5theditionof1947 28 2 神经兴奋的电传导1791年Galvani就发现了生物电现象19世纪电生理方法测定神经电传导的速度 发现 全或无 定律等20世纪30年代Young以乌贼大神经纤维作为研究材料 定量的测量神经电传导的电阻 电位及其在刺激前后的变化等40年代Hodgkin Huxley和Katz等研究Na K 与神经传导的关系 测定静息电位 动作电位等 29 意大利科学家伽伐尼 LuigiGalvani 1737 1798 DiagramofGalvani sfroglegs 1770s 1937Young推测可以使用巨大乌贼的轴突来了解神经细胞 JohnZacharyYoung 1907 1997 31 A LHodgkin A F Huxley Theysharedthe1963NobelPrizeinPhysiologyorMedicineforworkonthetransmissionofsignalsfromnervecells JohnCarewEccles 32 3 神经化学递质研究1905年Eliot发现电脉冲到达肌肉连结点时释放了肾上腺素1921年Loewi的蛙心实验 直接证明在心肌上的交感和副交感神经末梢分别释放出两种不同的化学物质1932年前后 Dale的系列的实验 取得了乙酰胆碱存在于内脏器官神经末梢的直接证据1934 1935年Cannon等提取交感神经末梢递质 1946年Eule阐明其为去甲肾上腺素1960年以来 对脑内递质开展了不少研究 发现了约30种不同的递质20世纪70年代发现脑啡肽等 33 4 脑功能研究1893年起Sherrington研究反射弧 提出抑制的概念 并认为抑制过程同兴奋过程同等重要Pavlov在20世纪初建立起 条件反射 的概念 证明条件反射是大脑活动的结果 19世纪有学者提出关于脑功能区的定位 部分切除狗脑皮层手术成功 并通过对尸体解剖的观察开始研究人大脑皮层功能区 34 20世纪30年代Foerster和Penfield在利用外科手术在清醒的病人身上 用电刺激大脑的不同部位引起不同反应20世纪40年代Sperry开始用猫和猴子做实验 切断大脑两半球间的连接 进行观察 60年代 对癫痫病人作两半球割裂治疗的观察 36 80年代 Sperry阐明人脑的左半球除具有抽象思维 数学运算及逻辑语言等各项重要机能外 还可以在关系很远的资料间建立想象联系 在控制神经系统方面人脑的左半球也很积极 起着主要作用 还发现人脑右半球也同样具有许多高级功能 如对复杂关系的理解能力 整体的综合能力 直觉能力 想象能力等 此外 它还被证实是音乐 美术及空间知觉的辨识系统 因此人的右脑蕴藏着很大的潜力 38 19世纪70年代Caton对兔 猫以及猴的实验表明大脑普遍存在着电的变化20世纪开始作脑电记录 Berger发现有心理活动时 如注意等 脑电波发生变化20世纪50年代开始 脑电的研究向探索与特定知觉有关的信号方向发展 开始了诱发电位的研究工作60年代 引入傅里叶分析仪70年代对人的视觉 听觉 甚至婴儿的感觉 都有了灵敏的检查指标 39 5 神经系统感知研究20世纪发展最快的是中枢神经系统对外界感觉的加工 识别信号 形成感知 测谎仪 百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介 I C S Sherrington 英 1857 1850 1900 1950 2000 C Golgi 意 1926 1934 神经元染色方法 1843 1852 R Cajal 西班牙 神经元学说 形态 1906 1952 1932 突触 定名 反射 概念 交互 抑制 反射学说 1889 1977 感觉神经纤维电活动 传入冲动大脑诱发电位 神经控制骨骼肌运动机制 E D Adrian 英 电生理 O Loewi 德英 1961 1873 1936 蛙心灌流实验 迷走物质 1968 1875 H Dale 英 神经末梢分泌 乙酰胆碱ACh 神经化学 1874 1965 1944 1963 1888 J Erlanger 美 H S Gasser 美 阴极射线示波器 神经纤维的分类ABC 1973 1881 W R Hess 瑞士 脑立体定位仪hypothalamus 方法学创新 1949 电生理 Oxf Cambridge 徒手切脑片银染神经元 染出神经末梢 发现神经元之间无原生质联系 生理科学进展2001 32 187 神经药理学 分子药理学 百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介 II 1850 1900 1950 2000 J C Eccles 澳大利亚 1914 1903 1963 A L Hodgkin 英 B Katz 德英 1917 A F Huxley 英 细胞内微电极 突触后电位 抑制性递质 突触 电压钳技术 动作电位的离子学说 数学方程表述 NM终板电位 递质 量子释放 1911 动作电位机制 1905 1983 U VonEuler 瑞典 交感神经递质 去甲肾上腺素 1970 儿茶酚胺代谢 影响CAs的药物 电生理 1912 J Axelrod 美 儿茶酚胺 神经化学 1913 左右脑 R W Sperry 美 1981 脑功能侧化 D Hubel 加美 1926 1924 T Wiesel 瑞典美 信息加工 视皮层 E Neher 德 1991 B Sakmann 德 大脑视觉信息加工 视觉系统发育的可塑性 膜片钳技术 单个离子通道电流记录 1999 英 澳 Cambridge Cambridge LeviMontalcini1986NervegrowthFactor NGF Italy 百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介 3 1850 1900 1950 2000 1926 1923 2000 P Greengard 美 1930 E Kandel 美 A Carlsson 瑞典 神经系统中的信号转导 蛋白磷酸化慢突触传递多巴胺 中国神经科学的发展开创者 张锡钧 协和 冯德培 协和 上海生理所 张香桐 上海生理所 脑所 两大事件 1950 巴甫洛夫 条件反射 学说 1966 1976 文化革命 期间主要做 针刺麻醉 研究方向 痛与镇痛 北京 北医 中医研究院上海 上医大 中科院生理所 脑所 神科所 视觉 上海 生理所北京 生物物理所 神经内分泌 西安 四军大 垂体前叶 上海 二军大 甾体受体 北医大 神经免疫 其它 发育 再生 杂志 生理学报 70 论文属神经生理1927年创刊 上海生理所 中国神经科学杂志 1998年创刊 上海二军大 中国疼痛医学杂志 1995年创刊 北医大 中国神经解剖杂志 1985年创刊 四军大解剖系 大型专著 神经科学纲要 1993年北医大韩济生主编 156万字 神经科学原理 1999年北医大韩济生主编 200万字 1 3特点 1 神经生物学具有清晰的发展脉络起初是对脑和神经系统的形态和总体功能的描述和分析 之后有更多的学科从不同侧面介入其中 日益迅速地把研究推向了细胞和分子水平 人们已经不再停留在现象的描述 而是更着眼于在不同层次上的机制的分析 从现象深入到机制是现代自然科学发展的共同特点 神经生物学可以说是其缩影 2 作为一门实验科学 神经生物学研究的进展在很大程度上有赖于研究技术和手段的发展和完善在20世纪初 Cajal对神经元形态的清晰描述 几乎完全仰仗于Golgi银染法的应用 40年代末 微电极记录和染色技术的发展使人们对神经活动的认识出现了革命性的变化 免疫组织化学方法的应用 使对神经递质的研究与形态学研究有机地结合起来 膜片钳位技术在20世纪70年代末的发明和发展 大大促进了对离子通道的研究 从而使人们对神经活动基本过程 信号发生 信号转导 突触传递等的了解奠定在更坚实的基础上 分子遗传学方法的不断更新 不仅使不少遗传性神经 精神疾患的缺损基因的定位得以成功 对了解特定基因在神经系统中的功能也起了重要的推动作用 无创伤脑成象技术的建立和完善 为认识活体脑的活动及分析其机制 提供了前所未有的有力工具 3 从神经生物学的发展史中 找到合适的实验标本很重要早期对神经兴奋和动作电位传导规律的阐明 枪乌贼大神经标本功不可没 对突触传递过程的了解 神经 肌肉接头标本所提供的信息 则甚于其他任何标本 近年来 对脑的高级功能 学习和记忆的基本机制的了解 在许多方面 依赖对一种低等的无脊椎动物 海兔的简单的神经系统的研究 一 形态学方法 辣根过氧化物酶法 horseradishperoxdase HRP HRP注射于神经末梢所在部位 通过非特异性胞饮方式摄入 逆向运至胞体 然后用组织化学方法显示 或经胞体摄入 顺向运送至末梢部位 1 束路追踪法 1 4研究方法 荧光染料法 主要用作逆向追踪 其优点是可作双标或多标 如核黄标记胞核 固蓝或荧光金标记胞质 生物素追踪法 一般使用生物素的衍生物作追踪剂 如生物胞素 biocytin 电泳导入脑内被神经元摄取 主要用于顺向追踪 该法有效范围明确 无过路纤维吸收问题 神经生物素 neurobiotin 用于顺行 逆行追踪 运送速度较快 灵敏度高 2 免疫组化法 immunohistochemistry 用特异性抗体显示组织化学成分的一种方法 免疫组化法的基本步骤有固定 制片 反应三步 常用于显示各种神经肽 3 原位杂交法 insituhybridization 用于显示细胞内的mRNA 标记物分为同位素和非同位素 同位素有32P 35S 3H 非同位素有生物素 biotin 地高辛等 4 激光共聚焦显微镜 laserscanningconfocalmicroscopy 用0 2 m的光束可透射厚0 5 1mm的细胞组织 用于神经递质 受体和转运体的定位 神经元结构的三维重建 活的神经细胞的动态变化 也可对活细胞进行连续扫描 显示细胞内某种成分 如Ca2 的变化过程 线粒体 内质网 高尔基体 染色体等的探测和分析 DNA RNA 酶的含量测定 二 生理学方法 1 行为学方法行为学方法是建立在条件反射基础之上 条件反射是著名的俄国生理学家巴甫洛夫于20世纪初提出的 条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化 在非条件反射基础上逐渐形成的 2 神经递质释放量的测定 脑透析法 可测定不同脑区的多巴胺及其代谢产物 氨基酸 乙酰胆碱 去甲肾上腺素 5 HT等 神经肽的测定较难 主要由于探头半透膜要求较高 1 电压钳 voltageclamp Hodgkin等 20世纪50年代电压电极 电流电极反馈放大器 feedbackamplifer 结合药理学方法 三 电生理学方法 2 膜片钳 patchclamp Neher和Sakmann 1976 nAchR单离子通道电流 1991 Noble 可测量单通道离子电流现在发现 通道的开放和关闭都是突然发生并似乎是全或无式的 开放的持续时间长短不一 但都有恒定的电导值 四 生物化学方法 1 放射免疫法 radioimmunoassay RIA 用抗原 抗体反应原理 将抗原标记上放射性同位素 用来测定与此抗原性质相同的物质 RIA包括以下基本步骤 样品采集 加样 反应 分离 测定抗原 抗体复合物的放射性 cpm 与标准曲线对照计算待测物质含量 2 高效液相层析 highperformanceliquidchromatography HPLC 利用分子间特异性及可逆性的结合 将其一方固定于层析的固定相中 使流动相中能特异性结合于该分子的物质与其结合 然后再改变条件 使被分离物质洗脱 用一定波长紫外光检测 HPLC是分离分析生物活性物质和受体的重要手段 五 分子生物学方法 1 基因分子克隆及表达人类染色体大约有3 109碱基和5 10万个基因 基因克隆是特定基因从基因组中分离出来在细菌中扩增的过程 克隆基因目的是获得大量的纯DNA分子 2 PCRPCR是一种酶促化学反应 可在含有多种核酸分子的混合液中选择性地大量扩增某一种核酸分子的特定序列 该方法具有极高的灵敏度和特异性 在含有多种杂质的条件下 可选择性扩增细胞基因组中一个特定的DNA片段达数百万至数千万倍 3 转基因 Transfersgene 根据遗传学原理 在体外合成含有突变序列的DNA片段 植入细胞染色体 通过制造定位定向转基因改变哺乳动物的基因型以产生转基因的动物 4 基因敲除 geneknockout 基因敲除是80年代初出现的一项新的基因工程技术 采用同源重组的方法 用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因 再应用转基因方法孵育出转基因动物 即为基因敲除动物 通过分析基因敲除动物单基因缺陷来研究基因调控 基因功能 建立疾病模型 药物作用及基因治疗 5 生物芯片技术