夏荣龙-河南省医学科技攻关计划项目申请书2008

编编 号号 项项 目目 分分 类类 重大攻关项目重大攻关项目 普普 通攻关项目通攻关项目 软科软科 学项目学项目 河河 南南 省省 医医 学学 科科 技技 攻攻 关关 计计划划项项目目申申请请书书 项项 目目 名名 称称 药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 作用机制的研究 研研 究究 领领 域域 基础基础 临床临床 预防预防 药学药学 其它其它 所属学科名称所属学科名称 普通外科 研究起止时间研究起止时间 2008 年 10 月 2011 年 10 月 承担单位 公章 承担单位 公章 河南大学第一附属医院 课题负责人课题负责人 夏荣龙 河河南南省省卫卫生生厅厅 2 河南省医学科学院河南省医学科学院 二二 O O 八八 年年 四四 月月 说明说明 1 本申请书各项内容必须实事求是 逐项认真填写 表达要明确 严谨 详细 具体 内容请务必打印 本申请书各项内容必须实事求是 逐项认真填写 表达要明确 严谨 详细 具体 内容请务必打印 必要时另附详细技术材料 凡填写内容不符合要求 手续不完备 字迹潦草者 不予受理和评审 必要时另附详细技术材料 凡填写内容不符合要求 手续不完备 字迹潦草者 不予受理和评审 2 申请者和协作者所在单位及其所属学术委员会必须认真评审 对项目的价值和可行性等提出具体意见 申请者和协作者所在单位及其所属学术委员会必须认真评审 对项目的价值和可行性等提出具体意见 共同签章后方可上报 共同签章后方可上报 3 创新项目创新项目 填写填写 研究领域研究领域 引进项目引进项目 填写填写 技术类别技术类别 4 所有栏目如页面不够 均可自行加页 所有栏目如页面不够 均可自行加页 中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 学学 科科 分分 类类 与与 代代 码码 Classification and code of disciplines GB T 13745 92 代码代码 学科名称学科名称 代码代码 学科名称学科名称 代码代码 学科名学科名 称称 0 310 11 医学生物化学医学生物化学 320 2440 内分泌学内分泌学 330 14 毒理学毒理学 310 14 人体解剖学人体解剖学 320 2445 风湿病学与自体免疫病学风湿病学与自体免疫病学 330 21 流行病流行病 学学 310 17 医学细胞生物学医学细胞生物学 320 2450 变态反应学变态反应学 330 24 传染病传染病 学学 310 21 人体生理学人体生理学 320 2499 内科学其他学科内科学其他学科 330 31 环境医环境医 学学 310 24 人体组织胚胎学人体组织胚胎学 320 27 外科学外科学 330 34 职业病职业病 学学 310 27 医学遗传学医学遗传学 320 2710 普通外科学普通外科学 330 37 地方病地方病 学学 310 31 放射医学放射医学 320 2715 显微外科学显微外科学 330 41 社会医学社会医学 310 34 人体免疫学人体免疫学 320 2720 神经外科学神经外科学 330 47 食品卫食品卫 生学生学 310 37 医学寄生虫学医学寄生虫学 320 2725 颅脑外科学颅脑外科学 330 51 儿少卫儿少卫 生学生学 310 41 医学微生物学医学微生物学 320 2730 胸外科学胸外科学 330 54 妇幼卫妇幼卫 生学生学 310 44 病理学病理学 320 2735 心血管外科学心血管外科学 330 57 环境卫环境卫 生学生学 310 47 药理学药理学 320 2740 泌尿外科学泌尿外科学 330 61 劳动卫劳动卫 生学生学 310 51 医学实验动物学医学实验动物学 320 2745 骨外科学骨外科学 330 64 放射卫放射卫 生学生学 310 54 医学心理学医学心理学 320 2750 烧伤外科学烧伤外科学 330 67 卫生工卫生工 程学程学 310 57 医学统计学医学统计学 320 2755 整形外科学整形外科学 330 71 卫生经卫生经 济学济学 310 61 生物医学工程学生物医学工程学 320 2760 器官移植外科学器官移植外科学 330 81 卫生管卫生管 3 理学理学 310 99 基础医学其他学科基础医学其他学科 320 2765 实验外科学实验外科学 340 20 特种医特种医 学学 320 临床医学临床医学 320 2799 外科学其他学科外科学其他学科 350 药学药学 320 11 临床诊断学临床诊断学 320 31 妇产科学妇产科学 350 10 药物化药物化 学学 320 1140 医学影像学医学影像学 320 34 儿科学儿科学 350 20 生物药生物药 物学物学 320 14 保健医学保健医学 320 37 眼科学眼科学 350 35 药剂学药剂学 320 1420 运动医学运动医学 320 41 耳鼻咽喉科学耳鼻咽喉科学 350 40 药效学药效学 320 1430 老年医学老年医学 320 44 口腔医学口腔医学 520 60 计算机计算机 应用应用 320 17 理疗学理疗学 320 47 皮肤病学皮肤病学 840 7170 计划生计划生 育学育学 320 21 麻醉学麻醉学 320 51 性医学性医学 870 图书馆 图书馆 情报与文献学情报与文献学 320 24 内科学内科学 320 54 神经病学神经病学 880 教育学教育学 320 2410 心血管病学心血管病学 320 57 精神病学精神病学 910 4030 卫生统卫生统 计学计学 320 2415 呼吸病学呼吸病学 320 64 核医学核医学 320 2420 结核病学结核病学 320 67 肿瘤学肿瘤学 320 2425 胃肠病学胃肠病学 320 71 护理学护理学 320 2430 血液病学血液病学 330 预防医学与卫生学预防医学与卫生学 简简 表表 编号 编号 项目名称项目名称 药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 作用机制的研究 研究领研究领 域域 基础医学基础医学 预防医学预防医学 临床医学临床医学 药学药学 其他其他 学科代码学科代码 320 2710 普通外科学技术类技术类 别别 国外技术国外技术 省外技术省外技术 自有技术自有技术 成果成果 专利专利 关关 键键 词词肝细胞癌 HCC 门静脉癌栓 PVTT 脐静脉 药物活性优化 起止时间起止时间2009 年 5 月 2012 年 5 月申申请请资资助助金金额额10 12 万元 姓姓 名名性性 别别 出生年出生年 月月 学学 历历学学 位位职职 称称职职 务务 夏荣龙男 63 年 9 月 研究生博士副教授业务院长 学术兼职学术兼职国际肝胆胰协会中国分会外科委员 河南省微创外科学会学术委员 开封 市医学会普外科专业副主任委员 中国现代外科学杂志编委 申申 请请 人人 情情 况况 联系地址联系地址河南省开封市西门大街 357 号邮邮 编编 475001 4 联系电话联系电话办办 0378 5661830 宅宅手手 机机留学情况留学情况 国国 年年 月月 从事专从事专 业业 肝胆外科E mail Xiaronglong63092 163 com 近近 3 3 年作为年作为 第一负责人第一负责人 承担科研课承担科研课 题题 国家级 国家级 0 项 项 省部级 省部级 1 项 项 厅级局 厅级局 2 项 项 其他类 其他类 项 项 获资助总额 获资助总额 4 万元 万元 近近 3 3 年参加年参加 科研课题科研课题 国家级 国家级 项 项 省部级 省部级 项 项 厅级局 厅级局 项 项 其他类 其他类 项 项 获资助总额 获资助总额 万元 万元 近近 3 3 年获得年获得 科技成果奖科技成果奖 国家级 国家级 0 项 项 省部级 省部级 1 项 项 厅级局 厅级局 0 项 项 其他类 其他类 项 项 获奖励总额 获奖励总额 2 万元 万元 名名 称称 河南大学第一附属医 院 属属 性性 独立科研机构独立科研机构 大专院校大专院校 医疗机构医疗机构 通讯地通讯地 址址 河南省开封市西门大街 357 号邮编邮编 475001 所所 在在 单单 位位 联联 系系 人人 靳艳 电电 话话 0378 5661857 传真传真 0378 5661846 主主 要要 研研 究究 内内 容容 和和 意意 义义 2525 0 0 字字 以以 内内 本课题采用肝癌切除 门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静 脉植泵治疗 HCC PVTT 新模式 研究规范治疗 HCC PVTT 的新策略 通 过体外细胞实验 检测肝癌细胞增殖 凋亡和细胞分化等指标 探讨亚砷 酸 派罗欣 丹参的抗 HCC 细胞药物活性优化的效果 通过裸鼠肝癌的模 型 从形态学观察肿瘤体积 抑癌率 抑转移率和从肿瘤学研究肝癌增殖 能力 肝癌细胞凋亡 肿瘤血管形成和肝癌转移倾向 探讨药物活性优化 对 HCC 发展的影响 通过临床分组实验 从治疗学研究其显效率 1 3 年生存率 二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因 芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达 揭示手术联合药物活性 优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的作用机制 研究人员研究人员 课题负责人情况课题负责人情况 姓姓 名名性别性别年龄年龄民族民族学学 历历专业与职称专业与职称职职 务务分分 工工 夏荣龙男45汉族博士肝胆外科 副教授 业务院长课题主持 5 参加人员情况参加人员情况 段永建 男 35 岁 汉本科 肿瘤科 副主任医师 科主任 临床实践 任艳彩女 53 岁 汉本科 病理学 主任医师 科主任 病理研究 陈景涛男 32 岁 汉 硕士实验中心 实验师动物实验 基因芯片 王贵红男 35 岁 汉硕士 肝胆外科 主治医师 主治医师临床实践 皇莆深强男 35 岁 汉本科 肝胆外科 主治医师 主治医师临床实践 来瑞平女 28 岁 汉硕士实验中心实验师细胞实验 免疫组化 8 研究内容和意义研究内容和意义 包括学术思想 立论依据 攻关目标和具体内容 理论 包括学术思想 立论依据 攻关目标和具体内容 理论 意义和应用价值分析 意义和应用价值分析 肝细胞癌 HCC 经门静脉转移易产生门静脉癌栓 PVTT 发生率约为 34 40 1 2 预后恶劣 临床上 HCC PVTT 易出现消化道大出血 肝功能衰竭 顽 固性腹水 肿瘤自发性破裂等严重并发症 导致病人病情急剧恶化 乃至死亡 患者的中位生存率仅为 2 7 个月 目前临床实践多积极采用以手术为主的综合 治疗 因治疗方案不统一 疗效依然较差 3 探讨有效地预防及治疗 HCC PVTT 的新策略 是目前肝癌研究的关键课题 1 HCC PVTT 形成的机制 我国 HCC 的特点大多伴有不同程度的肝硬化 一方面 HCC 无限增殖能力 PCNA 4 和凋亡的障碍 5 使肿瘤细胞过度增殖 并分泌大量的 VEGF 促进大量结构和功能异常肿瘤血管的形成 向癌组织周围 血管化浸润 转移 6 HCC 细胞间与血管内皮细胞间粘附分子 ICAM 1 异常 表达 7 有利于癌性血栓的形成 另一方面肝硬化假小叶形成将无序分隔压迫 肝静脉造成肝内血液动力学改变 产生门静脉高压和逆肝血流 使脱落的癌性 血栓容易在门静脉内停留 着床 门静脉回流血液富含消化吸收的营养物质和 胰腺内分泌所产生胰岛素 胰高血糖素和生长抑素等 为癌性血栓的肿瘤细胞 增殖提供了丰富的营养物质 此外 门静脉内微环境免疫细胞活性抑制 肿瘤 细胞可逃避机体免疫监视 最终形成 PVTT 8 2 HCC PVTT 的治疗的现状 肝癌切除并门静脉取癌栓病人 术后 1 3 5 年生存率分别提高为 67 7 40 3 和 20 9 即使对肿瘤不能切除的 病人 行门静脉取栓病人的生存率也高于非手术病人 9 表明门静脉取栓 能切实延长生存时间 而非手术组中 行介入治疗组的疗效又要优于保守治疗 组 因此 对 HCC PVTT 应采取积极有效的治疗措施 影响 HCC PVTT 疗效的主 要因素有 治疗方式 肿瘤数目 肿瘤大小 PVTT 病理类型 就术后生存率而 言 主瘤切除并门静脉切开取栓组优于单纯比较门静脉切开取栓组 单发肿瘤 组优于多发肿瘤组 主瘤 10cm 以上组明显低于主瘤小于 10 cm 组 机化型组 低于增生型 坏死型 混合型组主要原因就是癌栓不易清除 易早期复发 对 HCC PVTT 手术后定期行门静脉或肝动脉化疗可杀灭肝内 门静脉内的残余癌细 胞 延缓术后复发 其术后 1 3 5 年生存率明显高于非化疗组 但术后采用 何种治疗方法最佳有待进一步探讨 3 本课题研究内容 设计肝癌切除 门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸 派 9 罗欣 丹参 药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 基础和临床系列实验 研究规范治疗 HCC PVTT 的新策略 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 的体外细胞实验 探讨亚砷 酸 派罗欣 丹参的药物活性优化方案的抗 HCC 细胞效果 通过高转移人肝癌裸 鼠模型 LCI D20 探讨药物活性优化对 HCC 发展的影响 通过 HCC PVTT 临床 分组对照实验 揭示手术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的分子作 用机制 4 课题研究理论意义和应用价值 本课题通过基础和临床系列研究 从 细胞学 药效学 肿瘤分子生物学 基因学等方面 多角度 多层次地 揭示 手术联合药物活性优化经脐静脉灌注治疗 HCC PVTT 治疗作用的机制 探讨有 效地预防及治疗 HCC PVTT 的新策略 达到规范化治疗 易于推广 可转化为 成果 有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用 势必产生不可估量经济效益 和社会效益 10 国内外研究现状 水平及发展趋势国内外研究现状 水平及发展趋势 包括有何国家 单位曾经或正在从事 包括有何国家 单位曾经或正在从事 类似的研究 已经达到的水平 存在的主要问题以及发展趋势 本课题的技术类似的研究 已经达到的水平 存在的主要问题以及发展趋势 本课题的技术 关键 有无创新和特色 关键 有无创新和特色 肝细胞癌 HCC 经门静脉转移 易产生门静脉癌栓 PVTT 发生率约为 34 40 预后恶劣 目前临床实践因治疗方案不统一 疗效依然较差 患者的 中位生存率仅为 2 7 个月 探讨有效地预防及治疗 HCC PVTT 的新策略 为医 学界所关注的热点和难点问题 1 探索有效治疗 HCC PVTT 的新策略 显得刻不容缓 本课题通过临床应 用研究 致力于采用手术联合药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗 HCC PVTT 新模式 治疗途径创新的研究 目前 HCC PVTT 的治疗多采取以肝癌切除 门静 脉切开取癌 栓术为主综合治疗 据国内外文献记载以往 HCC PVTT 的术后采用诸如静脉化 疗 肝动脉及门静脉置泵灌注化疗等方法 临床应用颇有争议 10 11 13 静脉 化疗副作用大 全身反应严重 国内外学者倾向于局部化疗方案 肝动脉置泵 化疗目前较为通行局部化疗技术 但国内外进一步研究表明 其难以防治 HCC 11 门静脉系转移特点 形成 HCC PVTT 门静脉置泵灌注化疗 容易形成血栓 可 能造成医源性肝衰 在医学界达成共识 本课题组研究经脐静脉 门静脉系统 的终末枝 置泵灌注化疗技术 一方面增加了肝脏局部的药物浓度 封杀了 HCC 经门静脉转移易产生 PVTT 特点 另一方面克服了门静脉置泵化疗容易形成血 栓的缺点 又解除了患者因传统化疗带来痛苦 为 HCC PVTT 治疗开拓了一条 崭新的途径 药物活性优化的研究 亚砷酸 三氧化二砷 As2O3 是我国开发研制 的二类抗肿 瘤新药 其治疗白血病在临床上取得较满意的疗效 近年来积极尝试实体瘤治 疗 特别是 HCC 的治疗已取得突破 11 派罗欣 聚乙二醇化干扰素 具有抑 制肿瘤细胞增殖 调节机体免疫 诱导细胞分化和抗肿瘤血管形成 长期应用 可降低与病毒持续状态相关的 HCC 发生率和 HCC PVTT 术后的复发 12 丹参脂 溶性成分丹参酮可促进肝癌细胞凋亡 干扰肿癌血管的形成 丹参水溶性成分 成分丹参素可抗血小板凝集作用 阻止肿瘤细胞凝集成癌性血栓 抑制 PVTT 的形成 13 前期预实验研究表明 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细胞实验 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果 通过高转移 人肝癌裸鼠模型 LCI D20 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化抗肿瘤的 机制 预实验已取得成效 预实验小样本与临床应用研究复杂性的干扰 可能 造成偏差 故有待于本课题进一步证实 2 拟解决的关键问题及关键技术 脐静脉置泵灌注治疗 HCC PVTT 技术 脐静脉属门静脉系统的终末枝 出生后闭锁 2003 年本课题组采用肝癌切除 脐静脉植泵灌注化疗的治疗原发 性肝癌获得成功 术中将静脉灌注管放置脐静脉中 药泵埋于皮下 术后经皮 经脐静脉泵灌注药物化疗 其特点 一方面增加了肝脏局部的药物浓度 封杀 了 HCC 经门静脉转移易产生 PVTT 特点 另一方面克服了门静脉置泵化疗容易 形成血栓的缺点 又解除了患者因传统化疗带来痛苦 通过预实验多次改进 又开展了超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究 以及 基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究 取得 阶段性成果 目前已完成上百例手术 脐静脉置泵技术悉已成熟 已逐步形成 规模优势 抗癌药物活性优化的方案 2004 年以 肝癌切除加脐静脉植泵灌注 12 治疗原发性肝癌临床研究 成功申请到河南省科技厅的科技攻关项目 2005 年 又以 超声定位下 脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究 申请 到河南省教育厅科技攻关项目 2006 年再以 基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注 治疗原发性肝癌及分子机制的研究 申请到河南省卫生厅医学科技攻关计划 项目 使其以脐静脉植泵灌注治疗 HCC 实验成为系列研究 逐步完善 HCC PVTT 综合治疗研究体系 利用基因芯片技术 高通量检测凋亡基因 癌基因 抑癌基因 肿 瘤转移抑制基因及细胞信号等相关基因谱表达 分析基因谱差异 通过河南大 学天然药物研究所 河南大学医学分子生物学实验室和河南大学植物逆境重点 实验室进行交叉学科协作 3 本课题组的创新和特色 治疗途径创新 课题组在完成河南省科委 肝癌切除联合脐静脉植泵 灌注治疗原发性肝癌的临床研究 项目的基础上 采用 超声定位下脐静脉置 泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究 以及 基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌 注治疗原发性肝癌及分子机制的研究 取得阶段性成果 初步研究表明 1 3 年生存率明显提高 肿瘤复发率降低 二期手术切除率提高及负作用反应 率明显降低 为临床治疗更加规范 研究其治疗机制 形成治疗体系 便于推 广 药物活性优化特色 在 基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性 肝癌及分子机制的研究 的基础上 设计手术联合药物活性优化经脐静脉植泵 灌注治疗 HCC PVTT 新模式基础和临床系列研究 通过人肝癌细胞 BEL 7402 体 外细胞实验 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 的肿瘤学研究实验 HCC PVTT 临床分组对照实验的基础和临床系列研究 从细胞学 药效学 肿瘤分子生物 学 基因学等方面 多角度 多层次地揭示手术联合药物活性优化经脐静脉灌 注治疗 HCC PVTT 治疗作用的机制 13 预期研究的阶段性成果 最终成果 经济社会效益及其推广应用预期研究的阶段性成果 最终成果 经济社会效益及其推广应用 包括总 包括总 目标和分阶段目标 成果应写明推广应用或转让的可能性及社会 经济效益预目标和分阶段目标 成果应写明推广应用或转让的可能性及社会 经济效益预 测 测 研究目标 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细胞实验 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 实验和 HCC PVTT 临床分组对照实验的基础和临床系列研究 从细胞学 药效学 肿瘤分子生物学 基因学等方面 多角度 多层次地揭示肝癌切除 门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化经脐静脉植泵灌 注治疗 HCC PVTT 的作用机制 研究规范治疗 HCC PVTT 的新策略 本课题研究内容 1 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细胞实验 对空白实验组 亚砷酸组 派罗欣组 丹参组和药物活性优化组的施行分组对照 检测各实验组对人肝癌 细胞株 BEL 7402 的细胞增殖 凋亡和细胞分化等指标 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果 2 通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 对空白对照组 5 Fu 阳性对照 组和药物活性优化治疗组施行分组对照 从形态学角度观察肿瘤体积 抑癌率 抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力 肝癌细胞凋亡 肿瘤血管的形成 和肝癌转移倾向进行研究 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化抗肿瘤的 机制 3 通过 HCC PVTT 临床分组对照实验 对肝动脉灌注药物活性优化组 脐静脉灌注阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照 从治 疗学角度研究其显效率 1 3 年生存率 二期手术切除率及负作用反应率和从 基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达 探讨手 术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的作用机制 应用成果与社会 经济效益预测 肝癌切除 门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 新模式 临床上已取得阶段性成果 初步研究表明 1 3 年生存率明显提高 肿瘤复发率降低 二期手术切除率提高及负作用反应率明显降低 为 HCC PVTT 治疗开拓了一条崭新的途径 积极深入研究 形成新治疗体系 可转化为成果 势必产生良好临床疗效 易于推广 有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用 产生不可估量经济效益 和社会效益 14 拟采用的研究方法 技术路线拟采用的研究方法 技术路线 包括研究工作的总体安排 理论计算 实 包括研究工作的总体安排 理论计算 实 验设计 实验方法和步骤 工艺流程及其可行性论证 预计可能遇到的问题与验设计 实验方法和步骤 工艺流程及其可行性论证 预计可能遇到的问题与 解决方案 解决方案 一 研究方案 第一部分 体外细胞实验第一部分 体外细胞实验 1 目的 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细胞实验 对空白实验组 亚砷酸组 派罗欣组 丹参组和药物活性优化组的施行分组对照 检测各实验 组对人肝癌细胞株 BEL 7402 的细胞增殖 凋亡和细胞周期分析等 探讨亚砷 酸 派罗欣 丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果 2 材料与方法 2 1 研究对象 人肝癌细胞株 BEL 7402 中国科学院上海细胞生物学研究 所提供 2 2 主要试剂 亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产 派罗欣注 射液 聚乙二醇化干扰素 a 购自 Hoffman Roche 公司上海分公司 丹参注射 液有上海第九制药厂生产 RPMI1640 购自 GIBCO RBL 公司 MTT 购自华美公 司 细胞凋亡测试剂盒 购自武汉博士德生物工程有限公司 18 3 研究方法 3 1 细胞培养 常规复苏人肝癌细胞株 BEL 7402 在含有 100u ml 青霉素 100u ml 链霉素和 10 新生小牛血清的 RPMI 1640 培养液内 置 37 C0 5 C02孵箱中传代培养 每 2 3 天传代一次 取对数生长期细胞用于试验 3 2 随机分组原则 亚砷酸治疗组 亚砷酸注射液 浓度 10 mol L 观察 3 天 派罗欣治疗组 派罗欣注射液 浓度 10 g L 观察 3 天 丹 参治疗组 丹 参注射液 浓度 0 5mg L 观察 3 天 药物活性优化组 亚砷酸浓度 10 mol L 派罗欣浓度 10 g L 丹参浓度 0 5mg L 观察 3 天 3 3 MTT 法 四甲基偶氮哇盐比色法 检测各组对 BEL 7402 细胞增殖抑 制情况 计算细胞抑制率和药物的联合作用指数 采用 MTT 法观察不同浓度亚砷酸组 派罗欣组 丹参组单独或联合应用的 药物活性优化组对 BEL 7402 细胞生长的抑制作用 取对数生长期 BEL 7402 细 胞 用 0 15 胰酶分散细胞后计数 调整浓度为 5 104 ml 置入 96 孔细胞培 养板 200ul 孔 待细胞贴壁后 分别加入亚砷酸治疗组 派罗欣治疗组 丹 参治疗组和药物活性优化组 同时设一组不加药物的细胞组 作为实验对照组 每组均含 4 个平行孔 置 5 C02孵箱内分别培养 24h 48h 72h 结束前 4 6 小时 每孔加入 MTT 5mg ml lO ul 小心去除上清液 加入 DMSOl00u1 轻 轻震荡至 MTT 沉淀完全溶解 在多孔扫描分光光度计上 测定 570nm 波长下吸 光度 A 值 取 4 孔 A 值平均数 按公式计算药物对细胞的抑制率 细胞抑制率 1 一实验组平均吸光度值 对照组平均吸光度值 100 各药物单独应用时 对 BEL 7402 细胞的抑制作用是否呈现明显的剂量效应 依赖关系 计算各药物的中效浓度 IC50 应用中效原理分析和计算两种药物 的联合作用指数 两种药物的联合作用指数 combination index CI 的计算公式为 CI D 1 Dx 1 D 2 Dx 2 D 1 D 2 Dx 1 Dx 2 Dx 1和 Dx 2为两种药物单独应用产生 x 细胞 IR 时所需的浓度 D 1和 D 2为两种药物合用产生相同的 x 细胞 IR 时各自所需要的浓度 两种药物的相互作用为非排斥性 取 1 如果 CI1 认为两种药物呈现拮抗作用 如果 CI 1 则认为两种药物的 联合作用为相加作用 亚砷酸 派罗欣 亚砷酸 丹参和派罗欣 丹参的两两药 物合用均为 CI 1 可推断亚砷酸 派罗欣 丹参的抗肿瘤细胞的药物活性优化 效应 3 4 原位末端转移酶技术 TUNEL 检测细胞凋亡 计算凋亡率 细胞准备 将多聚赖氨酸粘片置 6 孔细胞培养板 取对数生长 BEL 7402 细胞 调至 5 104 ml 将细胞加入培养板内 2m1 孔 分别加入亚 砷酸治疗组 派罗欣治疗组 丹参治疗组和药物活性优化组 培养 48h 取出 爬片 PBS 洗涤 2 次 室温下 4 多聚甲醛固定 30min TUNEL 检测 参照试剂盒说明书按下列步骤进行 结果判断 细胞核中或核团有蓝紫色颗粒者为阳性细胞 即凋亡细 胞 每片爬片随机计数 500 个细胞 计算凋亡阳性细胞百分率 3 5 流式细胞仪检测凋亡阳性细胞比率和 DNA 细胞周期分析 在已准备好的 BEL 7402 细胞瓶中分别加入亚砷酸治疗组 派罗欣治疗 组 丹参治疗组和药物活性优化组 另设一瓶不加药物为对照 5 C02孵箱中 培养 48h 用 0 15 胰酶将细胞消化脱壁 PBS 洗涤 2 次 用冷 PBS 制备细胞悬液 O 5ml 加 5m1 75 冷乙醇固定 加 RNA 酶及碘化丙淀 闭光染色 30 mm 将样品用 FAC scan 型流式细胞仪检测细胞核 DNA 含量 数据用 multicycle 分析软件处理 4 统计学方法 实验结果以 x 士 s 表示 组间比较用单因素方差分析 以 a 0 05 为检验 水平 P 0 05 有统计学意义 第二部分第二部分 肝癌裸鼠动物模型实验肝癌裸鼠动物模型实验 1 目的 通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 对空白对照组 5 Fu 阳 性对照组和药物活性优化治疗组施行分组对照 从形态学角度观察肿瘤体积 抑癌率 抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力 肝癌细胞凋亡 肿瘤血 管的形成和肝癌转移倾向进行研究 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化 抗肿瘤的机制 2 材料与方法 20 2 1 材料 亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产 派罗欣注射液 聚乙二醇 化干扰素 a 购自 Hoffman Roche 公司上海分公司 丹参注射液有上海第九 制药厂生产 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 购自复旦大学肝癌研究所 鼠 龄 5 周 体重 17 20g 在 SPF 条件下裸鼠室内饲养 免疫组织化学试剂购自武汉 博士德生物工程有限公司 2 2 方法 利用复旦大学肝癌研究所建立的高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 将瘤源 原位接种于 36 只裸鼠肝内 随机分为 3 组 空白对照组 12 只 等体积生理盐水 腹腔注射 连续给药 14 天 阳性对照组 12 只 5 Fu 注射液 剂量 2 5mg kg 腹腔注射 连续给 药 14 天 药物活性优化治疗组 12 只 亚砷酸注射液 剂量 2 5mg kg 腹腔注 射 派罗欣注射液 1 5 107U kg 颈部注射 丹参注射液 剂量 2ml kg 联合用药 腹腔注射 连续给药 14 天 停药后 用 40g L 多聚甲醛 0 1mol L PB 固定液全身灌注固定法获取肝 脏 肺脏标本 2 3 肝癌生长转移情况 肉眼观察 记录肿瘤体积 肝内转移灶数目 转移灶累及肝叶数以及全身各器官转移情况 肝内转移灶数目及肺转移情况 并计算相应肿瘤体积 长径 短径 2 2 抑癌率 抑癌率 对照组平均瘤体 实验组平均瘤体 对照组平均瘤体 100 和抑转移率 抑转移率 对照组 平均转移率 实验组平均转移率 对照组平均转移率 100 2 4 病理形态学及组织免疫组化检查 将选取肝瘤组织 瘤周组织 邻 近肝近肝叶 左内叶 及肺组织行 HE 染色和免疫组化检查 从分子生物学角 度观察肝癌的四个指标 细胞增殖能力指标 增殖细胞核抗原 PCNA 肿瘤血管形成指标 血管内皮因子 VEGF 肝癌转移倾向指标 细胞间黏 附分子 1 ICAM 1 促肝癌细胞凋亡指标 凋亡指数 Apoptosis Index 2 5 统计学方法 计量资料以 S 表示 使用 SPSS 10 0 统计软件 对计量资料进行 t 检 验 对计数资料进行表 2检验 认为差异有统计学意义 R C 0 05P 第三第三部分部分 HCC PVTTHCC PVTT 的的临床分组对照实验临床分组对照实验 21 1 目的 通过 HCC PVTT 临床分组对照实验 对肝动脉灌注药物活性优 化组 脐静脉灌注阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照 从治疗学角度研究其显效率 1 3 年生存率 二期手术切除率及负作用反应率 和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达 探 讨药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的作用机制 2 病例收集 选择和分组 2 1 病例选择 90 名病例 来源于河南大学第一附属医院在 2003 年 2011 年收治的住院病人 病理确诊为 HCC PVTT 年龄 30 65 岁 性别不限 一期手术行肝癌切除 门静脉切开取癌栓术后 术后药物治疗 3 个疗程 一 期不能手术 术前药物治疗 1 个疗程后 二期手术行肝癌切除 门静脉切开取 癌栓术 术后药物治疗 2 个疗程 并计算二期手术切除率 2 2 病例分组为随机分组原则 肝动脉灌注药物活性优化治疗组 30 例 亚砷酸注射液 剂量 10mg d 派罗欣注射液 180 g d 丹参注射液 剂量 10ml d 联合用药 qd 21 天 间隔 4 周重复 总共 3 个疗程 脐静脉灌注阿霉素治疗组 30 例 阿霉素注射液 10mg d qd 21 间隔 4 周重复 总共 3 个疗程 脐静脉灌注药物活性优化治疗组 30 例 亚砷酸注射液 剂量 10mg d 派罗欣注射液 180 g d 丹参注射液 剂量 10ml d 联 合用药 qd 21 天 间隔 4 周重复 总共 3 个疗程 3 肿瘤学研究数据分析 3 1 治疗学角度 研究显效率 1 3 年生存率 手术切除率 二期手术 切除率 负作用反应率 3 2 从形态学角度 观察肿瘤体积 抑癌率 抑转移率 3 3 基因芯片技术分析 运用肿瘤基因芯片 Biostar 技术 高通 量观察高通量观察肿瘤凋亡相关基因 癌基因 抑癌基因 肿瘤转移抑制基因 等相关基因谱表达 分析差异表达 研究亚砷酸 派罗欣 丹参经脐静脉灌注治 疗 HCC PVTT 作用的分子机制 4 统计学分析 计量资料以 S 表示 使用 SPSS 10 0 统计软件 对计量资料进行他 t 22 检验 对计数资料进行表 2检验 认为差异有统计学意义 R C 0 05P 二 可行性分析 本课题基于大量临床治疗 HCC PVTT 病例 结合目前本领域研究动向的基 础上 采用手术联合药物活性优化经脐静脉贯序治疗 HCC PVTT 新模式 已取 得较好的临床疗效 初步得出 HCC PVTT 临床分组对照实验 的患者的 1 3 年生存率提高 12 4 7 8 以上 为研究规范治疗 HCC PVTT 的新策略 通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细 胞实验 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 实验和 HCC PVTT 临床分组对照实 验的基础和临床系列研究 揭示其治疗作用的机制 针对课题关键问题 在前 期预实验中进行研究和解决 通过预实验对 BEL 7402 细胞的抑制作用呈现明 显的剂量效应依赖关系 分析观察两种药物联用在很宽的效应范围内存在协同 效应与药物应用的先后顺序是否无关 增加应用 IC50法来判定两种药物的联合 作用 计算亚砷酸 派罗欣 亚砷酸 丹参和派罗欣 丹参的两两药物合用联合 作用指数 均为 CI 1 可推断亚砷酸 派罗欣 丹参的抗肿瘤细胞的药物活性 优化效应 对脐静脉置泵技术进行研究 改进经历手术直视脐静脉植泵 到腹 腔镜下辅助脐静脉植泵 再到超声定位下微创脐静脉置泵技术改进 从脐静脉 泵皮下留置时间 1 年 到改进后 2 年 再到导丝引导下脐静脉泵更换技术后 3 5 年 从脐静脉再通技术 脐静脉灌注化疗门脉系血流动力学改变等一系列问 题进行预实验研究 解决经脐静脉植泵的治疗途径的问题 总之 通过预实验 对通过人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细胞实验 高转 移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 和临床分组对照实验 基本解决课题关键问题和 修改课题研究方案 使课题的研究内容充实 实验方法可靠 技术路线清晰 确保本课题顺利完成的可行性 23 研究进度及完成期限研究进度及完成期限 课题总进度 年度计划进度 课题总进度 年度计划进度 5 1 年度研究计划 1 实验阶段 2009 年 1 月 2011 年 9 月 第一部分 2009 年 1 月 2009 年 4 月 人肝癌细胞株 BEL 7402 体外细 胞实验 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果 第二部分 2009 年 6 月 2009 年 8 月 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 实验 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制 第三部分 2009 年度 2011 年 9 月 HCC PVTT 临床分组对照实验 探 讨药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的治疗作用的机制 2 统计分析研究阶段 2011 年 9 月 2011 年 12 月 数据以Error Error S 表示 使用 SPSS 13 0 统计软件处理 阐述本课题采用 手术联合药物活性优化经脐静脉贯序治疗 HCC PVTT 新模式的作用机制 实现本课题目标已具备的条件和基础实现本课题目标已具备的条件和基础 1 过去的研究工作基础 过去的研究工作基础 2 已有或已有或 可否借用的主要实验设备 可否借用的主要实验设备 3 已经或可能进行的预试验或实验 已经或可能进行的预试验或实验 4 现有研究技现有研究技 术力量 术力量 1 工作基础 1 1 前期研究 近年来在 恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价 研究的 基础上 开展 丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究 发 表了 肝癌浸润转移机制研究的新进展 等国家级核心刊物论文 12 篇 因 丹参对肝癌致恶性梗阻性黄疸治疗作用实验研究 课题 获 2005 年度全国 医学优秀学术成果一等奖 2003 年采用肝癌切除 脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌获得成功 健康报 2004 年 6 月 2 日第三版登载 随即开展超声定位下脐静脉置泵灌注治疗原发 性肝癌以及亚砷酸经脐静脉灌注治疗肝癌方面取得成效 2004 年主持河南省科 技厅的科技攻关项目 肝癌切除加脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌的临床研究 2005 年主持省教育厅科技攻关项目 超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗 原发性肝癌临床研究 2006 年主持河南省卫生厅医学科技攻关计划项目 基 因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌分子机制的研究 1 2 本课题研究的预实验 解决课题的关键问题 调整了 人肝癌细胞 株 BEL 7402 体外细胞实验 各实验组药物剂量浓度 亚砷酸治疗组的浓度为 10 mol L 派罗欣治疗组的浓度 10 g L 丹参治疗组浓度 0 5mg L 和药物活 24 性优化组的浓度 初步得知亚砷酸 派罗欣 丹参联合可达到抗癌药物活性的优 化 确定了 高转移人肝癌裸鼠模型 LCI D20 的各实验组药物剂量和研究肿 瘤发展影响的四个检测指标 PCNA VEGF ICAM 1 和 Apoptosis Index 和检测 的方法 初步得出 HCC PVTT 临床分组对照实验 的患者的 1 3 年生存率提 高 12 4 7 8 以上 同时减少了全身化疗反应 负作用反应率明显降低的 预实验检测数据与基本符合临床实践的结果 预实验阶段已取得成效 为本课 题实验顺利实施提供有力保证 2 工作条件 以河南大学消化疾病研究所 肿瘤实验室以及病理实验室的公共实验设备 为平台 通过河南大学天然药物研究所 医学分子生物学实验室和河南大学植 物逆境重点实验室进行交叉学科协作 已具备各类病理学和实验技术 陆续开 展免疫组化检查 ELISA 法检测血液中 VEGF 及 ICAM 1 的含量 流式细胞仪检 测凋亡细胞技术等 熟练掌握细胞体外培养技术和动物实验模型制作 完成本课题尚缺乏的主要条件和基础完成本课题尚缺乏的主要条件和基础 点样仪 Cartesion 扫描仪 Scanarray 4000 和图像处理软件 Gene Pix Pro3 均有河南大学植物逆境重点实验室提供 DNA 抽取 探针的制备 芯片杂交及洗涤 扫描分析结果均有河南大学医 学分子生物学实验室和河南大学消化疾病研究所完成 肿瘤基因芯片 Biostar 有上海博星基因芯片责任有限公司购进 25 申请者和主要合作者情况 申请者和主要合作者情况 1 1 申请者和主要合作者已承担其它研究任务 申请者和主要合作者已承担其它研究任务 经费来源以及能用于本课题的时间 经费来源以及能用于本课题的时间 2 2 申请者和主要合作者近申请者和主要合作者近 3 3 年内发表的与年内发表的与 本课题有关的主要论文 著作和科研成果名称 按人填写 注明发表于何时 本课题有关的主要论文 著作和科研成果名称 按人填写 注明发表于何时 何刊物 何刊物 1 申请人简历申请人简历 夏荣龙副教授 医学博士 主任医师 硕士生导师 国际肝胆胰协会中国 分会外科委员 河南省微创外科学会学术委员 开封市医学会普外科专业副主 任委员 中国现代外科学杂志编委 1987 年毕业于宁夏医学院医疗系 获学士学位 2001 年毕业于西安交通 大学医学院肝胆外科专业 获外科学硕士学位 2007 年毕业于华中科技大学 同济医学院肝胆外科专业 获外科学博士学位 近年来开展 恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价 的基础上 完成 丹参 在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究 科研项目 发表了 肝癌 浸润转移机制研究的新进展 等国家级核心刊物论文 12 篇 针对豫东地区肝 炎 肝硬化和肝癌相对高发的特点 目前致力于利用多学科协作综合治疗肝癌 和药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的基础与临床研究 并获得省部级科 研项目 2 项 省卫生厅和教育厅科研项目 3 项 代表性论文 26 1 XIA RongLong CHEN XiaoPing The effects of Danshen injection on the malignant obstructive jaundice in the SD rat model J Journal of Huazhong University of Science and Technology Med Sci 2006 26 5 436 439 2 夏荣龙 陈孝平 丹参在大鼠恶性梗阻性黄疸时对肿瘤细胞凋亡的作用 J 第四军医大学学报 2006 27 19 1802 1804 3 夏荣龙 陈孝平 丹参对肝癌致梗阻性黄疸对 VEGF 表达的影响 J 第四 军医大学学报 2005 26 18 1673 1676 4 夏荣龙 刘青光 潘承恩 肝癌致梗阻性黄疸时丹参 ICAM 1 表达的影响 J 第四军医大学学报 2005 26 13 1216 1218 5 夏荣龙 刘青光 潘承恩 丹参对肝癌致鼠梗阻性黄疸对 PCNA 表达的影响 J 西安交通大学学报 医学版 2004 25 3 247 249 代表性科研 1 肝癌原位切除 脐静脉灌注治疗原发性肝癌的临床研究 NO 0524410077 河南省科技厅科技攻关项目 夏荣龙主持 2 超声定位下 脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究 NO 2006320003 河南省教育厅自然科学基金项目立项 夏荣龙主持 3 基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究 河 南省卫生厅医学科技攻关计划项目 NO 2006100 夏荣龙主持 4 丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究 河南大学重点项 目 NO 042DZR011 夏荣龙主持 代表性获奖成果 1 丹参对恶性梗阻性黄疸治疗作用的试验研究 2005 年度全国医学优秀学 术成果一等奖 主持人 2 胃粘膜延长成型食管与胃吻合动物实验和临床研究 2006 年度河南省科 技进步二等奖 主持人 2 2 主要合作者 主要合作者 段永建 副主任医师 硕士生导师 现任河南大学第一附属医院肿瘤科 放疗科主任 中华医学会河南省肿瘤放疗学会委员 27 代表性论文 1 介入治疗加三维适行放射治疗原发性肝癌的探讨 中国现代医学杂志 2005 15 13 2015 2017 2 食管癌后程加速超分割放射治疗同步化疗的远期疗效 第四军医大学学报 2007 28 18 1690 1692 3 三维适行放射治疗食管癌的临床研究 中国现代医学杂志 2006 16 23 3580 3582 28 项目考核目标项目考核目标 预期达到的技术 经济指标预期达到的技术 经济指标 预期达到的目标 1 通过体外细胞实验 检测肝癌细胞增殖 凋亡和细胞分化等指标 探讨亚砷酸 派罗欣 丹参的抗 HCC 细胞药物活性优化的效果 2 通过裸鼠肝癌的模型 从形态学观察肿瘤体积 抑癌率 抑转移率 和从肿瘤学研究肝癌增殖能力 肝癌细胞凋亡 肿瘤血管形成和肝癌转移倾 向 探讨药物活性优化对 HCC 发展的影响 3 通过临床分组实验 从治疗学研究其显效率 1 3 年生存率 二 期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察 肿瘤相关基因谱差异性表达 揭示手术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC PVTT 的作用机制 总之 本课题采用手术联合药物活性优化经脐静脉植泵治疗 HCC PVTT 新模式 研究规范治疗 HCC PVT