中药生物活性测定的指导原则解读

,2015版 药典四部9105中药生物活性测定指导原则解析,研发室 林 兵2016.07,基本内容,前 言,给质量控制带来了很大的挑战！,现代分析手段的大量应用中药质量控制水平有了巨大的飞跃,中药特点,尽管中药质量控制水平发展很快,但仍存在一些共性问题:含量高、容易控制的成分未必是药效成分含量过低的药效成分又不能保证与临床有效剂量之间的关联性用以控制和评价中药质量不够理想,前 言,2010版中国药典修订时增加了中药生物活性测定指导原则,2010版 药典 一部 附录 X C 中药生物活性测定指导原则,2015版药典修订时将上版药典附录整合为通则，并与药用辅料单独成卷作为四部9000 指导原则9105 中药生物活性测定指导原则,前 言,生物活性测定法：是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。,基本原则,1. 符合药理学研究的基本原则,随 机Randomization,对 照Control,重 复Replication,具备简单、精确的特点，应有明确的判断标准,分组或抽样时指按照机遇的原则进行，使各受试对象被分配到各组的机会均等，而不受主观因素的影响。 随机化的方法有抽签法、抛硬币法、随机数字表等。,设置对照，排除非实验因素的影响，消除实验误差，保证实验结果的可比性和实验结论的正确性。正常对照、模型对照、阳性对照、溶剂对照。,重复是指在相同实验条件下进行多次研究或多次观察。重复原则包括两个含义：是实验必须有足够的样本数或例数，在一次实验中有充分的重复；是要使实验结果可靠，必须多次重复实验。也就是说，实验要有一定的次数。,基本原则,2. 体现中医的特点,鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制，拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。,可参考的药效学实验模型：(1)治疗心肌缺血实验：垂体后叶致大鼠心肌缺血实验、小 鼠耐缺氧实验；(2)解热、镇痛实验：角叉菜胶或细菌内毒素解热实验、小鼠扭体实验；(3)止咳平喘实验：氨水刺激实验、离体豚鼠气管实验；(4)抗炎解毒实验：小鼠耳肿胀实验、毛细血管通透性实验、抑菌实验；(5)活血化瘀实验：血小板聚集实验、耳廓微循环实验。,基本原则,3. 品种选择合理,4. 方法科学可靠,优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法，待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。详见 四部 1431 生物检定统计法,拟开展生物活性测定研究的中药材或中成药应功能主治明确，其中，优先考虑治疗适应症明确单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。,基本内容,1. 实验条件,基本内容,Refinement（优化）通过改进条件，善待动物，提高动物福利，或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。Reduction（减少）指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的地动物能获得更多实验数据的科学方法。Replacement（替代）指使用其他方法而不用动物所进行的试验，以达到某一试验目的。或是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验,基本内容,近交系：BALB/c、C57BL; 远交系：KM、ICR小鼠；突变系：裸鼠,SD、Wistar大鼠,基本内容,采用标准品或对照品均应有理论依据和/或实验依据。国家标准中采用的标准品或对照品的使用应符合国家有关规定要求。,基本内容,2. 实验设计,基本内容,基本内容,方法学验证,例：舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法,药材选择：舒血宁注射液 功能主治：扩张血管，改善微循环。方 法：生物效价测定法模型选择：血小板聚集抑制模型动 物：家兔供试品： 舒血宁注射液(5 mL/支)对照品：金纳多注射液(5mL/支)试验方法：家兔颈总动脉放血75 mL，加3.8枸橼酸纳(1:9)抗凝，1 000 r/min离心10 min制备富血小板血浆(PRP)，剩余血样继续3 500 r/min离心10 min制备贫血小板血浆(PPP)。用血液分析仪测定PPP和PRP中的血小板数，利用PPP调节PRP中的血小板数在4.04.51012个/L之间。 取PPP 210 L加入测试杯，进行仪器调零。再取PRP 80 L ，分别加入不同质量分数的样品液20 L ，37孵育180 s，分别加入聚集诱导剂（ADP、PAF）10 L ，测定5 min内的最大聚集率。,中药注射液功能主治明确,两者原料均为银杏叶提取物,量效关系考察：取金纳多注射液，用0.9的生理盐水分别配制成梯度为85、72、61、52、44的样品液各1 mL，作为对照品。取舒血宁注射液1支，用0.9的生理盐水分别配制成梯度为85、72、61、52、44的样品液各1 mL，为供试品。按实验方法分别测定含药血浆的血小板最大聚集率。效价测定及可靠性考察：取金纳多注射液，同法配置成含注射液100(原液)、85%、72%的稀释液，作为对照品组(S)；取舒血宁注射液，同法配置成含注射液100(原液)、85%、72%的稀释液，作为供试品组(T)。按照S1、Tl、T2、S2、S3、T3的顺序(排除因S组和T组测定的先后次序引起的误差)，平行测定3次。按中国药典生物检定统计法中量反应平行线三三法进行统计学处理，考察结果的可靠性，计算T组的效价(PT)和可信限率(FL)。,效价测定结果：由于金纳多注射液在药典中尚无效价的规定，因此假设对照品(s)金纳多注射液的效价为100 u/mL，由于舒血宁注射液与金纳多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血宁注射液抑制血小板聚集的效果与金纳多相同，则其测得效价也应为100 u/mL，结果见表1。,表1 舒血宁注射液由ADP、PAF诱导的测得效价与可信限率,可靠性考察结果：表2，表3为两种测定方法的可靠性检验结果，结果显示两种诱导剂诱导的血小板聚集可靠性检验均合格，回归显著(P0.05)，可信限率均小于10，以上结果表明该