植物组织培养技术.ppt

书名 植物组织培养技术ISBN 978 7 111 44497 8作者 王洪习出版社 机械工业出版社本书配有电子课件 植物组织培养技术高职高专ppt课件 第二部分 组培基本理论与操作 主讲教师 王洪习联系方式 123antai 植物组织培养技术高职高专ppt课件 第三章 植物组织培养实验室构建与基本操作 植物组织培养技术高职高专ppt课件 本讲主要内容 组培实验室的的基本构成与基本设备组培实验室的设计原则玻璃及塑料器皿的洗涤实验用具及实验环境的灭菌无菌操作人员的要求与消毒 植物组织培养技术高职高专ppt课件 学习要求 知识目标 了解组培实验室的基本组成掌握组培实验室的设计原则 总体要求和设计方法掌握组培常用仪器设备的使用方法技能目标 能够根据需要和实际情况科学设计实验室熟练使用组织培养的仪器设备 植物组织培养技术高职高专ppt课件 第一节 组培实验室构建 组培实验室的基本构成组培实验室的基本设备组培实验室的设计原则组培实验室的设计案例 植物组织培养技术高职高专ppt课件 一 组培实验室的基本构成 洗涤室 植物组织培养技术高职高专ppt课件 1 洗涤室 功能 组培用具洗涤 干燥和贮存 材料预处理与清洗 组培苗出瓶 清洗与整理等 设计要求 10m2左右 房间宽敞明亮 方便工作 有电源 自来水和水槽 池 上下水畅通 地面耐湿 防滑 排水良好 便于清洁 植物组织培养技术高职高专ppt课件 仪器与用具配置 植物组织培养技术高职高专ppt课件 2 培养基配制室 功能 培养基的配制 植物材料的预处理设计要求 一般10 20m2左右 要求房间宽敞明亮 通风 干燥 便于多人操作 有电源 自来水和水槽 池 保证上下水道畅通 植物组织培养技术高职高专ppt课件 仪器与用具配置 恒温水浴锅 电饭煲 磁力搅拌器 磁力搅拌器 酸度计 电炉 电蒸馏水器 水处理中心 恒温培养箱 人工气候室 自动灌装机 3 灭菌室 功能 培养基 接种工具等灭菌 设计要求 一般为5 10m2 安全 通风 明亮 墙壁和地面防潮 耐高温 配备水源 水槽 池 电源或煤气加热装置和供排水设施 保证上下水道畅通 通风措施良好 配备 高压灭菌器或微波炉 烘干箱等 4 接种室与缓冲间 功能 植物材料的接种或培养物的转移等 结构 缓冲间 接种室设计要求 宜小不宜大 一般小接种室5 7m2 缓冲间2 3m2 密闭 干爽 清洁明亮 地面平坦无缝 顶棚及墙壁密闭光滑 吊装紫外光灯 配置横拉门 配备 超净台 工作台 搁架 医用小平车 细菌过滤器 解剖镜 紫外灯 接种工具等 医用小平车 组织培养常用的工具1 尖头镊2 扁头镊3 枪形镊4 弯头镊5 直形镊6 弯头剪7 尖头解剖刀8 解剖刀9 接种针 5 培养室 功能 培养离体材料 设计要求 培养室的大小可根据生产规模和培养架规格 数量及其它附属设备而定 不宜过大 面积10 20m2 充分利用空间和节能 有缓冲间或走廊 能够控光控温 保持密闭 干爽 整洁明亮 防止微生物感染 要求天花板 墙壁光滑平整 绝热防火 最好用塑钢板或瓷砖装修 地面用水磨石或瓷砖铺设 平坦无缝 方便室内消毒 并有利于反光 提高室内亮度 5 培养室 设计要求 摆放培养架 以立体培养为主 能够通风 降湿 散热 培养室外应设有缓冲间或走廊 培养室内用电量大 应设置供电专线和配电设备 并且配电板置于培养室外 保证用电安全和方便控制 配备 培养架工作台解剖镜照明设备定时器空调器干湿温度计除湿机换气扇 6 观察室 功能 观察与鉴定培养材料生长分化是否正常 是否脱毒和发生变异 设计要求 室内通风 清洁 明亮 干燥 安静 设备先进 保证光学仪器不振动 不受潮 不污染 不受光直射 配备 生物显微镜 切片机 酶联免疫检测仪 PCR扩增仪等 7 驯化棚室 功能 组培苗驯化移栽 设计要求 据规模来定 能够控温调湿 控光通风 配置 环控设施 弥雾装置 遮阳网 暖气或地热线 移栽床等设施 塑料钵 花盆 穴盘等移栽容器 草炭 沙子等移栽基质 注 室内驯化与设施下驯化均可 7 驯化棚室 二 设计原则与总体要求 设计原则防止污染 按照工艺流程科学设计 经济 实用和高效 结构和布局合理 工作方便 节能 安全规划设计与工作目的 规模及当地条件等相适应 总体要求实验室选址避开污染源 水电供应充足 交通便利 保证实验室环境清洁 可设计过道 设备防尘 外来空气的过滤装置 实验室必须满足实验准备 无菌操作和控制培养三个基本的工作需要 实验室建造满足组培的需要 地面 墙壁和顶棚等要采用最小的产生灰尘建筑材料 墙壁和天花板 地面的交界处宜做成弧形 便于日常清洁 管道要尽量暗装 安排好暗敷管道的走向 便于日后的维修 并能确保在维修时不造成污染 洗手池 下水道的位置要适宜 不得对培养带来污染 下水道开口位置应对实验室的洁净度影响最小 并有避免污染的措施 实验室各分室的大小 比例要合理 培养室与其他分室 除驯化室外 的面积之比为3 2 培养室的有效面积占培养室总面积的2 3 与生产规模相适应 明确实验室的采光 控温方式 应与气候条件相适应 一般采用人工光照和恒温控制 实验室可设计为密封式或半地下式 电源并经专业部门设计 安装和验证合格之后 方可使用 应有备用电源 设置防止昆虫 鸟类 鼠类等动物进入的设施 接种室 培养室装修材料耐消毒 清洁和冲洗 并设置能确保与其洁净度相应的控温控湿的设施 三 实验室设计例举 第二节 组培实验室的基本操作 玻璃及塑料器皿的洗涤与干燥常见玻璃仪器的使用实验用具及实验环境的灭菌无菌操作人员的要求与消毒 一 玻璃及塑料器皿的洗涤与干燥 组培试验或生产过程中清洁与否 由于所用玻璃仪器及塑料器皿的不清洁常常会导致外植体材料被污染而致使试验失败 因此 实验用器皿洗涤清洁工作是十分重要的基本操作 是做好组培的前提和关键之一 玻璃仪器的清洗初用玻璃仪器的洗涤 新购置的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质 可先用去垢剂 0 5 水溶液 或肥皂水洗刷 再用自来水洗净 然后浸泡1 2 HCl溶液中过液 次日取出用自来水充分冲洗 最后再用蒸馏水漂洗数次 置烘箱内烘干或倒置晾干备用 使用过的玻璃仪器的洗涤一般玻璃仪器洗涤 许多污染物 包括有机物及金属离子等 易粘附于玻璃容器的内壁上 故每次使用均须及时清洗 通常情况下先用自来水冲洗至无污物 再用去垢剂洗涤或浸泡于0 5 去垢剂水溶液中 将器皿内外 特别是内壁 仔细刷洗后 用自来水充分洗净 最后用蒸馏水漂洗数次 置烘箱 或微波炉 烘干或倒置在清洁处晾干备用 凡洗净的玻璃器皿 其壁上不沾有水珠 否则表示尚未洗净 应按上述方法重新洗涤 量具玻璃仪器不能烘烤 只能晾干或风干 对于进行高灵敏度的分析及检测实验所用的器皿 除用上述方法清洗外 还需采用其他特殊洗涤方法彻底清除污染物 一般是把玻璃器皿浸泡于铬酸洗液中4 6h或过夜 再分别用自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗 烘干或晾干备用 通过洗液处理的玻璃器皿 在其器壁上的有机污物会被完全清除 如有必要还可用浓HNO3洗涤及处理玻璃器皿 最后用双蒸馏水充分漂洗 这样将使器壁上污染的金属离子得以清除 具有传染性样品的容器 如病毒 传染病患者的血清等沾污的容器 应先进行消毒处理后再进行清洗 盛过毒物的容器 特别是剧毒药品和放射性同位素物质的容器 必须经过专门处理 确知没有残余毒物或放射性存在方可进行清洗 移液管 吸量管 的洗涤移液管每次使用后须及时用流水冲洗或浸泡于冷水中 特别是吸取粘滞性较大的液体 全血 血浆 血清等 后应立即用流水充分冲洗 以免物质干涸和堵塞移液管 通常使用过的移液管经自来水冲洗后 可浸泡于0 5 去垢剂溶液中或铬酸洗液中过夜 不少于4h 然后分别用自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗 晾干备用 塑料器皿的清洗聚乙烯 聚丙烯等制成的塑料器皿 在生物化学实验中已用的越来越多 第一次使用塑料器皿时 可先用8mol L尿素 用浓盐酸调pH 1 清洗 接着依次用无离子水 1mol LKOH和无离子水清洗 然后用1 3mol LEDTA除去金属离子的污染 最后用无离子水彻底清洗 以后每次使用时 可只用0 5 的去污剂清洗 然后用自来水和无离子水洗净即可 玻璃和塑料器皿的干燥实验中用到的玻璃和塑料器皿经常需要干燥 通常都是用烘箱或烘干机在110 120 进行干燥 定量的玻璃仪器不能加热 一般采取控干或依次用少量酒精 乙醚刷洗后用温热的气流吹干 硝酸纤维素的塑料离心管加热时会发生爆炸 所以决不能放在烘箱中干燥 只能用冷风吹干 洗涤液的种类及配制铬酸洗液 又称重铬酸钾 或钠 浓硫酸洗涤液 简称洗液 广泛用于玻璃仪器的洗涤 其配制方法如下 称取5g重铬酸钾 或钠 粉末放入250ml烧杯中 加5ml水 尽量使其溶解 然后边搅拌 边缓缓注入浓H2SO4l00ml 待洗液温度冷却至40 以下 将其转移到具玻塞的细颈干燥的试剂瓶内贮存备用 称取10g重铬酸钾粉末置于500ml烧杯中 加水20ml 尽量使其溶解 然后慢慢注入浓H2SO4180ml 随加随搅拌 冷却后贮于具玻塞的细颈试剂瓶中备用 量取100ml工业硫酸置于250ml烧杯中 小心加热 慢慢加5g重铬酸钾粉末 边加边搅拌 待全部溶解后 冷却并贮于具玻塞的试剂瓶中备用 浓HCl 工业用 常用于洗去水垢或某些无机盐沉淀 浓HNO3 常用于洗涤除去金属离子 10 3mol L 1EDTA溶液用于除去塑料容器内壁污染的金属离子 5 10 磷酸三钠 Na3PO4 12H2O 溶液 用于洗涤油污物 氢氧化钾 KOH 的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠 NaOH 溶液 适用于清除容器内壁污垢 但这两种强碱性洗涤液对玻璃仪器的侵蚀性很强 故洗涤时间不宜过长 使用时应小心慎重 有机溶剂 丙酮 乙醇 乙醚等可用于洗脱油脂 脂溶性染料等污痕 二甲苯可洗脱油漆类污垢 二 常见玻璃仪器的使用 移液管的使用容量瓶的使用滴管的使用玻璃棒的使用 三 实验用具及实验环境的灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一 这里所指的菌包括细菌 真菌 放线菌 藻类及其他微生物 其特点是 极小 肉眼看不见 无处不在 无时不有 无孔不入 在自然条件下忍耐力强 生活条件要求简单 繁殖力极强 条件适宜时便可大量滋生 所谓有菌 凡是暴露在空气中的物体 接触自然水源的物体 至少它的表面都是有菌的 所谓无菌 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体 经其他物理或化学的灭菌方法有效处理后的物体 高层大气 岩石内部 健康的动 植物的不与外部接触的组织内部 强酸强碱 化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的 灭菌是指用物理或化学的方法 杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体 即把所有生命的物质全部杀死 与此相关的一个概念是消毒 它指杀死 消除或充分抑制部分微生物 使之不再发生危害作用 显然经过消毒 许多细菌芽孢 霉菌厚垣孢子等不会完全杀死 即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物 所以通过严格灭菌的操作空间 接种 超净台等 和使用的器皿 以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物 在这样的条件下进行的操作 就叫做无菌操作 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的 甚至超过微生物的培养要求 这是因为培养基含有丰富的营养 稍不小心就引起杂菌污染 要达到彻底灭菌的目的 必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类 即 物理方法如干热 烘烧和灼烧 湿热 常压或高压蒸煮 射线处理 紫外线 超声波 微波 过滤 清洗和大量无菌水冲洗等措施 化学方法是使用升汞 甲醛 过氧化氢 高锰酸钾 来苏水 漂白粉 次氯酸钠 抗菌素 酒精等化学药品进行浸泡 擦拭 喷雾 熏蒸等方式处理 物品不同 适宜的灭菌方式亦不同 灭菌举例 培养基 无菌水的制备等 湿热灭菌金属器械 耐高温物品等 干热灭菌物体表面 喷雾 擦拭 紫外线等空气 紫外线 熏蒸 喷雾等皮肤 酒精擦拭灭菌不耐热的植物生长调节剂 过滤灭菌金属器械 管状玻璃制品 植物体材料等浸泡灭菌 四 无菌操作人员的要求与消毒 植物组织培养属于严格的无菌操作和生产 整个过程应严密监控其生产环境的洁净度 并应在无菌控制的环境下进行操作 相关的设备 物品及人员应采用适当的方法进行灭菌 以保证其无菌性 同时要防止被再次污染 植物组织培养实验室无菌技术操作制度 暂行 操作前准备无菌操作前30min通风 停止清扫地面 减少走动 以降低室内空气中的尘埃 操作区域要清洁 宽敞 操作者应剪指甲 穿实验服 换鞋 洗手 戴好帽子 口罩及无菌手套 操作中保持无菌工作人员应面向无菌区域 手臂应放在操作台面无菌区域内 不可跨越无菌区域 操作时 不可面对无菌区讲话 咳嗽 打喷嚏 无菌操作中 无菌物品一经取出 即使未使用 也不可放回无菌容器内 无菌物品每使用一次 必须重新灭菌消毒 且不可多次连续使用 以防止交叉污染 无菌物品的保管无菌物品和非无菌物品应分别放置 无菌物品必须存放在无菌容器或无菌包内 无菌包外要注明物品的名称 灭菌日期 物品按日期先后顺序放置 定期检查无菌物品保存情况 未污染无菌包的保存期一般以7天为宜 过期或包布受潮应重新灭菌 无菌操作人员的洗手要求 从事植物组织培养无菌操作的人员 洗手时要按 五步洗手法 即湿 搓