抗生素类药物分析

第十六章抗生素类药物的分析,药学院药物分析教研室,,Company Logo,【大纲要求】,1、掌握-内酰胺类的鉴别和高效液相色谱法等含量测定方法。2、掌握氨基糖苷类抗生素的鉴别试验，庆大霉素C组分的检查方法。3、掌握四环素类抗生素的鉴别试验和特殊杂质的检查方法。4、熟悉本类药物的化学结构与分析方法的关系。5、了解抗生素类药物中高分子杂质的控制方法。,药学院药物分析教研室,,Company Logo,抗生素的概念及特点,低化学纯度同系物多、异构体多、降解物多,活性组分的变异性生产过程中条件的变化,不稳定性不稳定性结构,是指“在低浓度情况下对某些生物的生命活动有特异性抑制作用一类化学物质的总称”,药学院药物分析教研室,第一节 概 述,,Company Logo,Quality Analysis/Quality Control-QA/QC,Identification,1、显色反应特殊基团的反应2、光谱法特征吸收3、色谱法保留行为4、生物学方法抗菌能力,药学院药物分析教研室,,Company Logo,Investigation,1、常规检查水份、酸碱度等2、有机和无机杂质检查3、异常物质的检查异常毒性、热原等4、其他检查其他共存组分,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（三）(Potency) Determination,1、微生物检定法稀释法比浊法管碟琼脂扩散法抑菌圈灵敏度高、需用量少适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大,Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少u/g,是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法,是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法,药学院药物分析教研室,,Company Logo,2、物理化学法High-performance liquid chromatographyLiquid chromatography-Mass spectrometr)UV容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少,1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照,仪器分析方法,药学院药物分析教研室,,Company Logo,抗生素的分类,内酰胺类抗生素氨基糖苷类抗生素四环素类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素放线菌素、多黏菌素苯烃胺类抗生素氯霉素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,第二节 -内酰胺类抗生素,6-APA,7-ACA,氢化噻唑环,氢化噻嗪环,药学院药物分析教研室,（一）结构,,Company Logo,发展史,1929年，弗来明(Alexander Fleming) 发现青霉素。1958年谢汉合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)成功。开创了半合成青霉素的时代1961年，头孢菌素C被发现，头孢菌素迅速发展。80年代:广谱碳青霉烯类上市。,,Company Logo,青霉素,（青霉素钾、钠）,药学院药物分析教研室,,Company Logo,氨苄西林（氨苄青霉素）,药学院药物分析教研室,,Company Logo,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,药学院药物分析教研室,,Company Logo,普鲁卡因青霉素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,头孢氨苄,药学院药物分析教研室,,Company Logo,头孢羟氨苄,药学院药物分析教研室,药品名,R-取代基,青霉素钾阿膜西林氨苄西林苯唑西林,药学院药物分析教研室,,Company Logo, 理化性质,1、酸性与溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不稳定性,药学院药物分析教研室,,Company Logo,酸性,结构特点与性质,与碱金属(Na+、K+)成盐,（1）羧基,易溶于水,药学院药物分析教研室,,Company Logo,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（2）手性C,头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（3）共轭体系,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,青霉素的降解途径,与含水量和纯度密切相关,药学院药物分析教研室,,Company Logo,青霉素的降解产物,青霉噻唑酸青霉素酶青霉酸强酸性环境青霉烯酸弱酸性环境青霉醛强酸性-加热青霉胺强酸性-加热/青霉素酶-重金属,降解产物,药学院药物分析教研室,,Company Logo,三、鉴别反应,（一） 显色反应,羟肟酸铁反应,药学院药物分析教研室,,Company Logo,茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,药学院药物分析教研室,,Company Logo,双缩脲反应,似肽键,紫,药学院药物分析教研室,,Company Logo,与重氮苯磺酸反应,橙黄色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,药学院药物分析教研室,,Company Logo,与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,药学院药物分析教研室,,Company Logo,K+、Na+的火焰反应,（二）各种盐的反应,药学院药物分析教研室,,Company Logo,沉淀反应（青霉素盐）,遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,药学院药物分析教研室,,Company Logo,重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,药学院药物分析教研室,,Company Logo,与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,mp,,Company Logo,样品、分解产物,Cu2+,药学院药物分析教研室,,Company Logo,pH3.8,分子重排,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,本类药物的紫外光谱鉴别法通常利用最大吸收波长鉴定法：将供试品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸光度进行鉴定。如头孢唑啉钠的紫外鉴别法：取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含16g的溶液，在272nm的波长处有最大吸收。,,Company Logo,2. 红外吸收光谱(IR) 红外吸收光谱反映了分子的结构特征，各国药典对收载的-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素的-内酰胺环羰基的伸缩振动(1750cm-11800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1，1525 cm-1，1680 cm-1)、羧酸离子的伸缩振动(1600cm-1，1410cm-1)是该类抗生素共有的特征峰。,,Company Logo,3180cm-1N-H,内酰胺 C=O,1780cm-1,3470cm-1O-H,1690cm-1仲酰胺C=O,1250cm-1C-O,以阿莫西林为例,药学院药物分析教研室,,Company Logo,对照品对照法,药学院药物分析教研室,,Company Logo,三、检查,本类抗生素的杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸光度来控制杂质量的。此外，有的还进行结晶性、抽针与悬浮时间等有效性试验，部分抗生素还检查有机溶剂残留量。 (一) 聚合物 (二) 有关物质和异构体 (三) 吸光度 (四) 有机溶剂 (五) 结晶性,,Company Logo,四、含量测定,各国药典收载的青霉素类和头孢菌素类的含量测定除少数几个样品采用抗生素微生物检定法测定外，大多采用HPLC测定方法。 高效液相色谱法是近年来发展最快的方法，它能有效地分离供试品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质，并能准确定量，适用于本类药物的原料、各种制剂及生物样本的分析测定。ChP2010收载的本类抗生素中除磺苄西林钠采用微生物检定法测定含量外，其余均采用HPLC法测定含量。,,Company Logo,含量测定-容量法和仪器分析法,1、碘量法原理：利用青霉素或头孢菌素不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，并以标准对照法计算含量。,药学院药物分析教研室,,Company Logo,反应分两步进行：1. 水解反应(按化学计算量进行)2. 氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),药学院药物分析教研室,第一步,第二步,药学院药物分析教研室,,Company Logo,V样空,V样,V对空,V对,药学院药物分析教研室,,Company Logo,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,药学院药物分析教研室,,Company Logo,空白,样品,Na2S2O3,药学院药物分析教研室,,Company Logo,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环 境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定 法一致,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（1）弱酸性 pH4.5,碱 I2 IO3- + I-,酸 普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀,（2）温度 2426,温度38 未水解的供试品亦消耗碘,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差。,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（1）灵敏度高,样品 : 碘 = 1 : 8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,药学院药物分析教研室,,Company Logo,原料,药学院药物分析教研室,,Company Logo,可见-紫外分光光度法,2.,原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在320 nm360 nm处有强烈吸收特性，并且该降解产物与Cu2+或Hg2+形成稳定并易于测定的配位化合物，从紫外分光光度法测定。硫醇汞盐法酸水解铜盐法羟肟酸比色法,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（1）原理,青霉烯酸硫醇汞盐,青霉素族,HgCl2,（咪唑）,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（2）方法,对照品法,计算,pH 9,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（3）注意,侧链有-NH2时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述 反应,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,青霉素族,pH=4,青霉烯酸,Cu2+,稳定的化合物,A320nm,药学院药物分析教研室,,Company Logo,红色,NaOH,羟肟酸衍生物,药学院药物分析教研室,,Company Logo,4、高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件（1）Column -CN ODS C18 C8 -Ben（2）mobile phase/flow rate（3）column temperature （4）detection wavelength（5）workstation sample preparation,药学院药物分析教研室,,Company Logo,实验注意事项（1）色谱峰要达到较好的分离基线分离(base separation)（2）需要标准品对照，用外标法定量（3）可同时测定多个组分的含量（4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰,药学院药物分析教研室,,Company Logo,生物样本中-内酰胺类抗生素的分析,血浆尿样唾液胆汁,生物样本,色谱柱：Hypersil ODS C18 (200 mm4.6 mm, I.D. 5m)样品制备：取血浆200L，加入内标5L，再加入HCLO4，窝旋提取,Internal standard IS,药学院药物分析教研室,,Company Logo,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,药学院药物分析教研室,,Company Logo,链霉素：,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,药学院药物分析教研室,,Company Logo,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,药学院药物分析教研室,,Company Logo,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,药学院药物分析教研室,庆大霉素,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,药学院药物分析教研室,,Company Logo,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,药学院药物分析教研室,,Company Logo,多与硫酸成盐,碱性,（一）,药学院药物分析教研室,,Company Logo,链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212,药学院药物分析教研室,药学院药物分析教研室,,Company Logo,羟基胺结构,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（2）Molisch反应 具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，加入 萘酚（红紫色）或蒽酮（蓝紫色）（3）Elson-Morgan反应 水解产生的N-甲基-L-葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。,药学院药物分析教研室,红紫色,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（4）麦芽酚反应链霉素的特征反应 链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍，生成-甲基-羟基-吡喃酮（麦芽酚），该化合物与Fe3+在弱酸性溶液中形成红紫色配位化合物。（5）坂口反应链霉胍的特有反应 向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物1；8-羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物2。产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物。,药学院药物分析教研室,紫红,麦芽酚,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（六）色谱法,（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。 点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品 对照液：硫酸链霉素标准品 + 硫酸 新霉素标准品+ 硫酸卡那霉素标准品,药学院药物分析教研室,,Company Logo,判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液 相同， 对照液应显示分离清晰的3个斑点 否则试验无效。（2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留时间。（七）光谱法 IR法, UV法BP（2005）庆大霉素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,三、特殊杂质的检查（1）链霉素中链霉素B的检查TLC法硅胶G板（使用前需活化）、展开剂 甲苯-冰乙酸-甲醇（50: 25: 25）、0.2二羟萘的乙醇20硫酸混合液（2）庆大霉素中组分C的检查衍生化后HPLC色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索 组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效,药学院药物分析教研室,,Company Logo,+,+,4,10,.,pH,吲哚衍生物,巯基醋酸,邻苯二醛,氨基,max = 330nm,衍生化原理,1.,药学院药物分析教研室,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,药学院药物分析教研室,,Company Logo,RPHPLC,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面积归一化法,药学院药物分析教研室,药学院药物分析教研室,,Company Logo,微生物检定法 各国药典主要采用,HPLC法 常用于体内药分,药学院药物分析教研室,,Company Logo,氨基糖苷类抗生素的效价测定主要有微生物检定法和HPLC法。氨基糖苷类抗生素的HPLC测定法可分为离子交换(酸性条件下在阳离子交换柱上分离)、离子对(以烷基磺酸盐为反离子)和反相HPLC法，由于本类抗生素多数无紫外吸收， 不能直接用紫外或荧光检测器，需进行柱前或柱后衍生化，或采用电化学检测器、蒸发光检测器检测。ChP2010采用HPLC-蒸发光散射法测定硫酸卡那霉素、硫酸依替米星等药物的含量。,,Company Logo,第四部分：四环素类抗生素,Trtracyclines TC,药学院药物分析教研室,,Company Logo,一、理化特性（1）酸碱两性C4（二甲氨基）、C10（酚羟基）（2）旋光性含有手性中心（一般为左旋）（3）紫外吸收特性具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）（4）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇基（5）不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加深,药学院药物分析教研室,弱酸性环境,ETC,差向四环素,药学院药物分析教研室,强酸性环境,ATC,脱水四环素,药学院药物分析教研室,碱性环境,EATC,异四环素差向脱水四环素,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,药学院药物分析教研室,,Company Logo,盐酸土霉素的鉴别,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象(四)IR和UV,比较保留时间,药学院药物分析教研室,,Company Logo,(一) 有关物质 四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和贮存过程中易形成的异构杂质、降解杂质(ETC、ATC、EATC)等。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用HPLC法控制四环素类抗生素中的有关物质。,三、杂质检查,,Company Logo,(二) 杂质吸光度 四环类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，如差向四环素为淡黄色，因其不稳定又易变成黑色；脱水四环素为橙红色；差向脱水四环素为砖红色。此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的外观色泽变深。因此和BP2010均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸光度的限量。,,Company Logo,ChP2010规定的盐酸四环素的杂质吸光度测定方法：取本品，在2025时加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，置4cm的吸收池中，自加0.8%氢氧化钠溶液起5分钟时，在530nm的波长处测定，其吸光度不得过0.12(供注射用)。,,Company Logo,(三) 残留有机溶剂 一些四环素类药物需要控制残留有机溶剂，如ChP和BP规定盐酸多西环素检查乙醇，限量均为4.3%6.0%。,,Company Logo,HPLC法,盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及ATC峰间的 分离度均应符合要 求。 定量方法：外标法以峰面积计。,药学院药物分析教研室,,Company Logo,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。,药学院药物分析教研室,,Company Logo,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,药学院药物分析教研室,,Company Logo,2、基本特点对青霉素而言,青霉噻唑多肽外源性的（24003500）青霉素聚合物内源性的（聚合度） 母核参与的聚合反应N型聚合反应 侧链参与的聚合反应L型聚合反应,分类,药学院药物分析教研室,,Company Logo,（1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质（2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3）异构