金黄色葡萄球菌随机引物扩增dn多态性的分型.doc

浅谈随机扩增dna的多态性(rapd-dna)分型是近年来继质粒谱分析、脉冲场电泳、探针杂交等分子生物学分型方法之后，发展起来的又一基因分型技术，在建立后的短短几年内，它已在医院感染菌株基因多态性分析中，显示了巨大的优势。为此，我们对金黄色葡萄球菌进行rapd基因分型，以探讨其在医院感染研究中的意义。 一、材料与方法 1.菌株来源：1998年2月1999年4月住广州市三所综合性医院患者，分别取自痰、血液、伤口分泌物、腹水等临床标本，经分离鉴定确定为金黄色葡萄球菌，共85株。医院感染72株，社区感染13株。由一个实验室统一鉴定到种。所有菌株-70冰箱保存。 2.医院感染诊断标准：参照卫生部医政司医院感染监控协调小组制定的诊断标准。 3.工具酶及主要试剂：蛋白酶k、taq dna聚合酶及dntps均购自上海生物试剂公司。 4.dna提取：500 l lb液体培养基增菌，加入25 l蛋白酶k，10%sds10 l 37温育1小时。酚、氯仿、异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，溶解于50l双蒸水中，低温保存。 5.引物：5-atgtaagctcctggggattcac-3由中国科学院上海生物工程有限公司合成。 6.聚合酶链反应(pcr)条件：反应体积为50 l，含引物2.0 mml/l，4种dntp各125mml/l，镁离子浓度3.5 mml/l，待测模板1 l，taq聚合酶1 u。pcr反应条件：921 min，25 2 min，65 1 min，共35个循环，扩增产物在70 mv电压，2 h，2%的琼脂糖凝胶电泳，透射紫外仪下照相观察。 二、结果 rapd分型结果：可扩增出18带，共分为37个基因型。3株未分型。 三、讨论 应用随机引物pcr进行指纹图谱分析，相同引物，反应控制的条件(如退火温度镁离子浓度、模板浓度)不同，所得指纹图谱亦不相同，进行pcr循环时退火温度一般选择在2535，40以上时扩增效率逐渐减弱，另外镁离子浓度对扩增也有影响，随着镁离子浓度的增加，长的扩增带逐渐增多，短的扩增带逐渐减少，一般认为镁离子浓度在3.54.5 mmol/l时，长短片段均能得到良好的扩增1，2。与肖征等3报道相比，我们选择了更低的退火温度及稳定的镁离子浓度，以确保rapd的分辨率。该方法具有常规pcr技术的快速、安全、简便、灵敏的特点，而且其引物是通用的，不必预先知道该物种的基因序列。在医院感染研究部门中，应用相同的引物，可用于不同细菌的快速流行病调查，尤其是暴发流行的调查，为及时控制感染争取了时间，所以，该技术为医院感染分子流行病学研究提供了切实可行的研究方法。 本研究分型结果提示，三所医院之间基因型差别较大，且同一医院医院感染株与社区感染株基因型完全不同。说明在同一医院内菌株存在着流行趋势，a医院社区感染株基因型相近但不相同，可能与来就诊患者相对集中在该社区有关。另外b医院与c医院无论是医院感染株，还是社区感染株基因型均存在相同或相近，从地理位置上而言，这两所医院距离相对较近(约2公里)，离a医院均较远(10公里)。进一步说明了菌株流行趋势，不仅与是否为医院感染株有关，与地理位置亦有关。国内学者贺学英等4应用脉冲场电泳分型对金黄色葡萄球菌的研究认为医院感染株为小流行，社区感染株为散发，与本文观点不完全相同。 从1998年1月初11月底，a医院神经外科13例不同时期住院的患者不同部位的分离株，分别有6株和7株分为两个基因型，说明这些菌株是同源的，同一病区存在着交叉感染，同一病区可有不同的基因型流行，同一菌株可以长期流行。英国报道5在一所医院的重症监护病房病区6个月分离出17株耐甲氧苯西林金黄色葡萄球菌，其中1株来自护理员的手，16株来自患者，16/1 7株具有相同基因型，说明护理员的手可能是造成传播的感染源。有文献报道6呼吸道及鼻腔携带往往是其重要的感染源，通过健康工作人员手及空气传播造成感染，而且这种感染方式往往是造成暴发流行的主要原因。严格洗手、操作时戴口罩、加强消毒隔离措施是控制金黄色葡萄球菌交叉感染的根本措施。 参考文献 1welsh jg, meclellang m. finger printing genomes using pcr with arbitrary primers. nucleic acid res, 1990,18：7213-7238. 2williams j, kubelik ar, livak kj, et al. dna polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. nucleic acid res, 1990,18：6531-6535. 3肖征，吴坚，杨继勇，等.重复片段引物聚合酶链反应应用于医院感染流行病学研究.中华医学检验杂志，1999，22：232-234. 4贺学英，周惠平.pfge方法在医院感染病原学监测中的应用.中华医院感染学杂志，1998，8：75-77. 5tambic a, power eg, analysis of an outbreak of non-phage-typeable methicillin-resistant staphylococcus aureus by using a randomly amplified polymorph dna assay. j clin microbiol, 1997,35：3092-3097. 6pujol m, prna c, pallares r, et al. nosocomial staphyl