高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七实验七 高效液相色谱高效液相色谱 HPLC 法测定邻苯二甲酸酯法测定邻苯二甲酸酯 一一 实验目的实验目的 1 学习高效液相色谱仪的基本操作方法 2 了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法 3 了解高效液相色谱法在日常分析中的应用 二二 实验原理实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相 借助于高压输液泵获得相对较高流 速的液流以提高分离速度 并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分 离和分析的一种色谱方法 在高效液相色谱中 若采用非极性固定相 如十八烷基键合相 极性流动 相 即构成反相色谱分离系统 反之 则称为正相色谱分离系统 反相色谱系 统所使用的流动相成本较低 应用也更为广泛 定量分析时 为便于准确测量 要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好 的分离度 分离度 R 的计算公式为 R 2 t R2 t R1 1 7 W1 W2 式中 t R2 为相邻两峰中后一峰的保留时间 t R1 为相邻两峰中前一峰的 保留时间 W1及 W2为此相邻两峰的半峰宽 除另外有规定外 分离度应大于 1 5 本实验对象为邻苯二甲酸酯 又称酞酸酯 缩写PAE 常被用作塑料增 塑剂 它被普遍应用于玩具 食品包装材料 医用血袋和胶管 乙烯地板和 壁纸 清洁剂 润滑油 个人护理用品 如指甲油 头发喷雾剂 香皂和洗 发液等数百种产品中 但研究表明 邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥 着类似雌性激素的作用 是一类内分泌干扰物 待测物性质见表1 表 1 色谱柱测试条件 出峰次序样品组成 1邻苯二甲酸二甲酯 DMP 2邻苯二甲酸二乙酯 DEP 3邻苯二甲酸二丁酯 DBP 如果要检测不同条件对谱图分离的影响 可按表 1 配制几种物质的混合溶 液 在不同条件下进行 HPLC 分离检测 三三 仪器与试剂仪器与试剂 1 仪器 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪 50ul 微量注射器 2 试剂 试剂 甲醇 色谱专用 高纯水 四四 实验步骤实验步骤 1 色谱条件 色谱柱 辛烷基硅烷键合硅胶 C8 柱温 室温 流动相 初始为高纯水 30 甲醇 70 检测器 DAD 检测器 检测波长 220nm 进样体积 100 l 定量环 实际注射每次可控制在 200 l 2 待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液 邻苯二甲酸二甲酯 0 3880g L 邻苯二 甲酸二乙酯 0 2770g L 邻苯二甲酸二丁酯 0 3776g L 然后各取 1mL 储备液用水和甲醇 20 80 稀释至 10mL 作为待测溶液 3 色谱测定 1 按操作规程开启电脑 开启脱气机 泵 检测器等的电源 启动 Agilent 1100 在线工作软件 设定操作条件 流量为 1 000ml min 2 待仪器稳定后 开始进样 将进样阀柄置于 LOAD 位置 用微量注射器吸 取混合物溶液 50ul 注入仪器进样口 顺时针方向扳动进样阀至 INJECT 位置 此时显示屏显示进样标志 3 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比 4 实验完毕 清洗系统及色谱柱 依次用甲醇 水 60 40 甲醇 水 70 30 直到纯甲醇作流动相清洗 每次清洗至基线走稳 至少清洗 15min 五五 实验结果实验结果 1 流动相的比例为 高纯水 20 甲醇 80 流速为 1 0ml min 记录色谱 图 并计算分离度 012345 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 mAU min 根据分离度公式 计算分离度 R1 2 466 R2 13 92 2 流动相的比例为 高纯水 20 甲醇 80 流速为 0 5ml min 记录色 谱图 并计算分离度 0246810 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 mAU min 根据分离度公式 计算分离度 R1 3 136 R2 17 29 3 流动相的比例为 高纯水 30 甲醇 70 流速为 1 0ml min 记录 色谱图 并计算分离度 20246810121416 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 mAU min 根据分离度公式 计算分离度 R1 5 991 R2 37 65 4 定性过程 混合物和 DEP 实验得到如下的色谱图下 012345 0 1000 2000 mAU min 由图可以看出 混合溶液的出峰顺序为 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二乙 酯 邻苯二甲酸二丁酯 六六 思考题思考题 1 比较图 2 和图 3 可知 在缓冲液作流动相的情况下 实验得出的峰 形较好 但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相 图 2 缓冲液作流动相得出的色谱图 图 3 乙腈 水 5 95 作流动相得出的色谱图 答 因为缓冲溶液对色谱柱的损伤较大 使用后 不易清洗 成本高 并 且这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的 2 流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤 答 HPLC 要求流动相非常的纯净 否则他会对色谱柱和仪器产生不可逆损 坏 由于色谱柱填料颗粒很细 内腔很小 流动相中的细小颗粒会使色谱柱和 毛细管堵塞 而仪器进样阀也易被小颗粒堵塞 因此流动相在使用前要用砂芯 漏斗过滤 3 请分析实验结束后 怎样清洗柱子 分为两种情况 第一种情况为 流动相用到缓冲溶液 第二种情况为流动相不用缓冲溶液 答 分析实验结束后 先将体系中盐分去除干净 再依次用甲醇 水 60 40 甲醇 水 70 30 直到纯甲醇作流动相清洗清洗柱子 并最 后灌满 对于不用缓冲溶液 以 20 倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗 可以在甲醇 乙腈等水溶性溶剂之后 改用 50 DMSO 或 DMF 水溶液加以清洗 清洗几十 倍柱体积后 再逐步置换返回原系统 4 根据实验结果分