免疫细胞的分离及其表面标志检测技术

免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,第一节 免疫细胞的分离 一、 外周血单个核细胞分离 二、 淋巴细胞的分离 三、 T细胞和B细胞的分离 四、 T细胞亚群的分离,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类 一、 细胞表面标志及亚群 二、 B细胞表面标志 三、 NK细胞表面标志第三节 其他的免疫细胞第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用 一、免疫细胞表面标志的检测方法 二、 淋巴细胞表面标志检测的临床意义,思考题小结,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090,不同细胞密度不同,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,密度梯度离心(Ficoll)离心,二 、淋巴细胞分离,贴壁粘附法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心）,（去单核细胞）,E花环沉降法 尼龙毛柱分离法,三、T细胞和B细胞的分离,四、T细胞亚群的分离,亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法,荧光激活细胞分离仪分离法,磁珠大小可以选择,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较,免疫磁珠法细胞分选过程,免疫磁珠细胞分选装置,全自动细胞分选系统,流式细胞分析仪,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。,细胞表面分化抗原（CD抗原）,适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,SmIg？SmIg是B淋巴细胞的主要标志，它相当于受体，是膜蛋白的一部分，用于感受抗原刺激，激活细胞。通过Ig分类测定，可判断B淋巴细胞的分化程度,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,T细胞及NK细胞,第三节 其他的免疫细胞,抗原提呈类细胞表面标志,FITC（异硫氰酸荧光素）：绿色530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色575nm,二抗荧光色素,第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用,免疫细胞表面标志的检测方法淋巴细胞表面标志检测的意义,一、免疫细胞表面标志的检测,抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 流式细胞分析法,二、淋巴细胞表面标志检测的意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化,思考题,1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？5.T细胞和B细胞进一步区分亚群的依据是什么？,6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？7.细胞表面标志的检测方法有哪些？8.利用细胞表面标志（CD抗原）分离细胞的方法有哪几种？9.T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物标志是什么？10.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？,小 结,淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是CD抗原。,进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。,根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅