溶解肠杆菌yh16 抗汞操纵子的克隆与分析

1 / 8溶解肠杆菌 YH16 抗汞操纵子的克隆与分析【摘要】 目的 通过对从污染地区分离出的抗汞菌株溶解肠杆菌 YH16的研究，获得新的抗汞操纵子基因，为汞污染环境的微生物修复打下基础。方法 通过质粒消除实验确定抗汞基因的位置，通过构建基因文库的方式筛选获得新的抗汞操纵子基因(mer)。结果 YH16的抗汞操纵子位于质粒上，该操纵子长达 6 048 bp，由 7个 ORF组成，依次为 merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA，与典型的 Tn501mer操纵子和 Tn21 mer操纵子相比，缺少merR。结论 获得了缺少 merR基因的 mer操纵子，具有理论研究意义，并为抗汞工程菌的构建打下基础。 【关键词】 抗汞质粒;质粒敲除;mer 操纵子;汞污染)Abstract:Objective In order to obtain the Hg?resistance operon,the gene library of mercury?resistance strain: Enterobacter dissolvens sp. YH16 was constructed. Methods Plasmid?knockout experiment had been used to posit the Hg?resistance gene,the gene library and bioinformatics analyzing tools had been used to screen the Hg?resistance gene. Results The mer genes were posited in the 2 / 8plasmid and organized as merT，merP，merC，merA，merD，tnpA，tnpA,closely related to that located in Tn501 and Tn21,but lacking A different mer operon gene was obtained,which might lay a basis for the further study on the structure analysis and gene clone of it.Key words:Hg?resistance plasmid; plasmid?knockout; mer operon; Hg pollution随着工农业生产的发展和人类活动的不断加剧，环境中汞污染物的排放量与日俱增。环境中的汞可被转化为毒性很强的甲基汞，有可能通过食物链富集并进入人体，对神经、免疫、生殖系统等造成功能上的损害，从而威胁人类健康1。自然界存在的抗汞细菌是平时解决环境中汞污染的主角，它们可以将环境中的有机汞降解为无机汞，并进一步还原为毒性低、易挥发的金属汞2。目前已经公认微生物对汞及其化合物的抗性通常是由细胞内质粒或跳动基因上复杂转座子中的抗汞性操纵子(mer 操纵子)决定的3。在以往的研究中，通过连续富集培养与驯化的方式，获得了一株具有高抗汞活性的菌株 Enterobacter dissolvens sp. YH16，其对 HgCl2的 24 h汞去除率达3 / 870%4。进一步研究发现，YH16 的 mer操纵子位于其质粒上，通过构建 YH16菌株质粒基因文库，获得了 mer操纵子基因，为降解汞生物工程菌的构建奠定了基础，对解决环境中的汞污染问题具有重要的应用意义。1 材料与方法培养基LB培养基与 LA培养基按照分子克隆手册配制5。菌株大肠杆菌 XL1?Blue hsdR17,supE44,recA1,endA1,gyrA46,thi?1,relA1,lac/F?由本实验室保存。抗汞菌株 Enterobacter dissolvens sp. YH16由本实验室从汞污染土壤中分离获得。pBluescript sk(-) 质粒购自 TaKaRa公司。酶和试剂各种限制性内切酶、DNA marker、X?Gal、IPTG 购自TaKaRa公司，T4 连接酶、去磷酸化酶购自 MBI公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。菌株 Enterobacter dissolvens sp. YH16的质粒消除用 EB对 YH16的质粒进行消除，处理浓度与温度时间分别为 20 mg/L，45 ，24 h;20 mg/L，30，24 h;10 mg/L，45 ，24 h。将处理后的培养液稀释并涂 LB平板，4 / 830培养过夜后影印到含 HgCl2 20 mg/L 的 LB平板上，30 培养 24 h观察结果，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒 DNA，电泳检测。抗汞质粒的转化Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒的提取，XL1感受态的制备与转化参照分子克隆手册进行5。选择培养基为含有 HgCl2 20 mg/L的 LB培养基。 抗汞质粒基因文库的构建参照分子克隆手册提取 Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒和 pBluescript sk(-)质粒5。YH16 质粒DNA首先经 Hind、BamH、Pst、EcoR小量不完全酶切后电泳，选取最佳内切酶 Hind。再经 Hind大量不完全酶切后电泳，按照 3 s DNA Gel Purification kit试剂盒说明书割胶回收 610 kb片断。pBluescript sk(-)经Hind 酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的 DNA片断与去磷酸化的克隆载体按 51 的比例 16 连接过夜，转入大肠杆菌 XL1，并涂布 LA平板，进行蓝白斑筛选。目标亚克隆的筛选挑取白色转化子至 LB液体培养基中，37 摇床培养 10 h左右后(A600 控制在左右)，以 1 %的量接入含5 / 8HgCl2 20 mg/L的 LB液体培养基中，30 、160 r/min培养 1 d，分批处理样品，再用原子吸收光谱测量 LB中的汞4,6。同时提取质粒酶切验证。亚克隆测序与分析测序由上海博亚生物公司完成。对插入片断通过 ORF Finder (open reading frame finder) (http:/projects/gorf)寻找读码框，并采用 BLASTn (http:/BLAST/cgi?)进行同源性分析。2 结果与分析菌株 Enterobacter dissolvens sp. YH16的质粒消除用传统的碱裂解法提取 Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒并电泳证实，YH16 含有细胞内质粒。质粒消除后，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒后电泳，结果见图 1。实验发现，抗汞活性丢失菌株质粒已丢失，说明抗汞基因可能位于质粒上。菌株 Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒直接转化大肠杆菌实验质粒可以在不同的微生物之间迅速转移，并赋予受体菌相应的基因型与表型变化，选择将 YH16的质粒转化进入与溶解肠杆菌亲缘关系非常近的大肠杆菌 XL1中，获得6 / 8转化菌株 YZXL?1。结果表明，获得了 YH16质粒的 YZXL?1拥有了抗汞能力，最高能在含 HgCl2 40 mg/L的 LB培养基上生长，24 h 去汞率高达%，处理不同时间后汞残留量见图2。对 YZXL?1提取质粒发现，其质粒电泳图与 YH16原始质粒完全相同，结果见图 3，说明它们来自于同一质粒。菌株 Enterobacter dissolvens 质粒 DNA的提取和不完全酶切分别使用 Hind、BamH、Pst、EcoR不完全酶切 YH16质粒 DNA，并电泳检测，结果见图 4，确定 Hind为最佳内切酶。连接、转化以及转化子的检验用去磷酸化的载体与纯化后的酶切片段连接过夜，纯化后电击转化 XL1。取 100 L 的菌液涂布到添加了X?gal、IPTG 和 20 mg/mL HgCl2的 LA 平板上，30 培养过夜，获得白色菌落 3个，分别命名为YZ16?1，YZ16?2，YZ16?3。将单菌落接种到含有 20 mg/mL HgCl2的 LA液体培养基中培养并甘油保存。检验 3个亚克隆的抗汞活性。研究发现，克隆子YZ16?3具有最高的抗汞活性，24 h汞去除率为 %，处理后的汞残留量结果见图 5。阳性克隆 YZ16?3的质粒酶切验证与测序7 / 8挑选降解率高的阳性克隆子 YZ16?3提取质粒并酶切，结果见图 6。从图中可知，YZ16?3 连接上了大约 6 kb和 kb左右的 2个片段。将其送至生物公司测序，测序结果略。序列分析通过测序与 ORF分析发现，YZ16?3 所含重组质粒上的插入基因全长为 7 488 bp， 其中 mer操纵子长达6 048 bp，由 7个 ORF组成。经 blast发现，7 个ORF依次为merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA，与典型的Tn501 mer操纵子 Tn21 mer操纵子相似7。将 7个 ORF序列进一步比对发现，tnpA 与Enterobacter aerogenes plasmid R751 来源的 tnpA 100%同源(genebank：)。merT、merC 与其他种属来源基因差异较小，尤其与 Pantoea agglomerans来源的 merT、merC 仅有 5个氨基酸的差别(genebank：;genebank：)。merA、merP、merD 与 Klebsiella pneumoniae来源的merA、merP、merD 同源性很高(GenBank:;GenBank: ;GenBank: )，但 merA N末端缺失 82个氨基酸。 3 讨 论不同来源的 mer操纵子具有不同的组分和多样的排8 / 8列顺序，革兰阴性菌 mer操纵子的基因排列大部分是一个典型 merRTP(C)AD型2，2 种典型的 mer操纵子结构如图8所示2。然而 YH16来源的 mer操纵子并不以调控基因merR开始，相似的情况曾在革兰阴性菌中被发现,缺少merR/merD操纵子的 Shewanella putrefaciens是革兰氏阴性 mer操纵子模式的另一个例外，这个质粒 mer操纵子是一个 merTPCA排列，到目前为止，还是一个未知的 mer调控方式8。YH16的 merA的 N末端缺失 82个氨基酸，有报道称这可能是利用一个不常见的半胱氨酸的糖派生物分支硫醇，代替