BOP基因的克隆及鉴定

1 BopBop 基因克隆基因克隆 摘要 以 pUC18 质粒为载体 bop 基因为目的基因 通过 PCR 扩增出含目的基 因 将克隆载体 pUC18 和 bop 基因经限制性内切酶酶切后 在 T4DNA 接酶连接 下 形成重组质粒并转化入大肠杆菌 DH5a 通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转 化子 对重组子进行 PCR 和酶切 电泳鉴定检测完成了 bop 基因额的克隆 关键词 基因克隆 PCR BOP基因 第一章 1 前言 1 1 基因工程 狭义上仅指基因工程 是指将一种生物体 供体 的基因与载体在体外进行拼接重组 然后转入 另一种生物体 受体 内 使之按照人们的意愿稳定遗传 表达出新产物或新 性状 重组 DNA 分子需在受体细胞中复制扩增 故还可将基因工程表征为分子克 隆 Molecular Cloning 或基因克隆 Gene Cloning 广义上包括传统遗传操作中的杂交技术 现代遗传操作中的基因工程和细 胞工程 2 是指 DNA 重组技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技术两大组 成部分 上游技术 基因重组 克隆和表达的设计与构建 即 DNA 重组技术 下游技术 基因工程菌 细胞 的大规模培养 外源基因表达产物的分离 纯化过程 广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴 广义的基因工程是一个高度的统一体 上游重组 DNA 的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想 下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证 基因工程产业化的基本原则 基因工程是指重组 DNA 技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技 术两大组成部分 上游技术指的是基因重组 克隆和表达的设计与构建 即重 组 DNA 技术 而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的 大规模培养以及基因产物的分离纯化过程 基因工程是利用重组技术 在体外通过人工 剪切 和 拼接 等方法 对各种 生物的核酸 基因 进行改造和重新组合 然后导入微生物或真核细胞内 使 重组基因在细胞内表达 产生出人类需要的基因产物 或者改造 创造新特性 的生物类型 从实质上讲 基因工程的定义强调了外源 DNA 分子的新组合被引入到一种 新的寄主生物中进行繁殖 这种 DNA 分子的新组合是按工程学的方法进行设 计和操作的 这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力 克服了固有的生物 种 species 间限制 扩大和带来了定向改造生物的可能性 这是基因工程的 最大特点 基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体 DNA 在体外 人工连接 构成新的重组的 DNA 然后送到受体生物中去表达 从而产生遗传 物质的转移和重新组合 1 1 2 PCR 技术基本原理 3 PCR 技术的基本原理 该技术是在模板 DNA 引物和四种脱氧核糖核苷酸 存在下 依靠于 DNA 聚合酶的酶促合成反应 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板 借助一小段双链 DNA 来启动合成 通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与 单链 DNA 模板中的一段互补序列结合 形成部分双链 在适宜的温度和环境下 DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物 3 OH 末端 并以此为起始点 沿模板 5 3 方向延伸 合成一条新的 DNA 互补链 PCR 反应的基本成分包括 模板 DNA 待扩增 DNA 引物 4 种脱氧核苷酸 dNTPs DNA 聚合酶和适宜的缓冲液 类似于 DNA 的自然复制过程 其特异性 依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR 由变性 退火 延伸三个基本 反应步骤构成 模板 DNA 的高温变性 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间 后 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成为单链 以便 它与引物结合 为下轮反应作预备 模板 DNA 与引物的低温退火 复性 模 板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 55 左右 引物与模板 DNA 单链的互补 序列配对结合 引物的适温延伸 DNA 模板 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的 作用下 以 dNTP 为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保存复制原理 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性 退火 延伸三过 程 就可获得更多的 半保存复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模 板 每完成一个循环需 2 4 分钟 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍 2 1 3 感受态细胞 感受态细胞 competent cell 理化方法诱导细胞 使其处于最适摄取 和容纳外来 DNA 的生理状态 主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大 直观的说 使得细胞膜表面 出现一些孔洞 便于外源基因或载体进入感受态细胞 由于细胞膜的流动性 这种孔洞会被细胞自身所修复 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达 不仅可以检验重组载体是否构 建成功 最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验 如蛋 白质表达纯化等工作 2 4 1 4 酶切鉴定 实验在重组质粒构建 重组质粒pUC18 bop采用BamH I Hand 双酶切鉴 定 在对双酶切产物进行1 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像图中可以看到所得条带 都不是很清晰 有拖尾现象出现 这可能由于未待胶完全凝固时加样了 重组 质粒条带有明显拖带出现 这与质粒提取 提纯操作有关 但可以看出其分子 量同bop基因分子量 1200bp左右 一至 酶切能进一步证实bop基因的成功克 隆 但就实验设计来看 为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区 别 笔者建议将克隆载体pUC18质粒 PCR扩增产物 酶切后的克隆载体及目的 基因在一块琼脂糖凝胶上电泳 2 2实验材料与仪器 2 1实验材料 2 1 1 生物材料 大肠杆菌 Escherichia coli DH5 克隆载体pUC 18由武汉大学东湖分校生 物技术实验室保存 含bop基因的pUC 19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金 卫华老师提供 2 1 2 生化材料 T4DNA连接酶 BamH I及Hind 核酸内切酶等均购自大连Takara公司 氨苄 青霉素 Amp 购自上海生工公司 Marker购自Fermentas公司 电泳用琼脂糖 及细菌培养用琼脂均购自晶美公司 DNA回收试剂盒购自MBI公司 2 2主要实验试剂 2 2 1 LB液体培养基 精确称取胰化蛋白胨lg 酵母提取物0 5g NaCI lg放 入烧杯内 加蒸馏水充分溶解后定容至100mL 121 高压下蒸汽灭菌20min 储 5 存于4 备用 2 2 2 LB固体培养基 取配置好的未高压蒸汽灭菌的LB液体培养基50ml加入细 菌培养用琼脂 Bacto Agar 0 5g 混匀后121 高压蒸汽灭菌20min 储存于 4 备用 2 2 3 碱性裂解液 精确称取葡萄糖0 495g Tris碱0 0303g 二水乙二胺四 乙酸二钠0 146g与小烧杯中 用蒸馏水充分溶解后定容至50ml 2 2 4 碱性裂解液 精确移取0 2mol L的NaOH 20 L 1 的SDS 20 L 加 蒸馏水160 L混匀 注意 0 2mol L的NaOH和1 的SDS分开配 临时混合用 2 2 5 碱性裂解液 精确移取5mol L的乙酸钾30ml 冰乙酸5 8ml 加入蒸馏 水并定容至50ml 2 2 6 上样缓冲液 精确称取溴酚蓝2 5mg 加入60 甘油 0 6ml 50 EDTA0 5g 摇匀后加蒸馏水至1ml 2 2 7 0 1mol L CaCl2 精确称取1 19无水CaCl2定容至100ml 121 121 高压蒸汽灭菌20分钟 4 C保存 2 2 8 灭菌蒸馏水 蒸馏水水分装后121 高压蒸汽灭菌后 4 保存备用 2 3主要实验仪器 洁净工作台 等级 100 级 上海博迅实业有限公司医疗设备 高速离心机 D 37520 sigma 电子天平 JY2002 上海衡平仪器仪表厂 分析天平 AUY120 SHIMADZU 数显鼓风干燥箱 GZX 9240 MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 MJ 300BS 霉菌培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 6 超速离心机 D 78532 Tuttlingen Hettich 微量加样枪 凝胶成像系 PCR仪 恒温振荡器 CHA S 国华企业 稳压稳流电泳仪 JY 600PJ 北京君意东方 调速多用振荡器 HY 4 国华电器有限公司 美的电冰箱 美的集团电冰箱制造有限公司 3实验方法 3 1 菌种活化 1 LB 培养基的配置 称取蛋白胨 1g 氯化钠 1g 酵母提取物 0 5g 放于烧杯中 加适量蒸馏水 搅拌溶化并定容至 100ml 完全溶解后 分装到两个三角瓶中 每个三角瓶中 各 50ml 向其中一个三角瓶中加入 1 2g 琼脂粉后 塞上棉塞 并用报纸和棉线 扎紧瓶口 2 灭菌 将枪头 50mlLB 固体培养基 50mlLB 液体培养基 装有牙签的培养皿 10 支试管 四个培养皿放入灭菌锅 121 灭菌 20min 3 无菌接种 在无菌操作台中 取出 LB 固体培养基 待其温度降至 50 左右 不烫手 加入 50 L 氨苄青霉素 混匀后 倒三个平板 培养基凝固后 分别划线接种含 PUC18 PUC19 质粒的大肠杆菌菌种 编号 1 2 平板倒置放在 37 培养箱 中培养过夜 4 挑单菌落 在无菌操作台中 取出 LB 液体培养基 待其温度降至 50 左右 不烫手 加入 50 L 氨苄青霉素 充分混匀后 分装于 10 支试管中 每支试管各 5ml 7 用镊子取无菌牙签挑取 1 2 平板上的单菌落 接种于于 5ml LB 含氨卞青霉素 0 1g ml 的液体培养基内 37 250rpm 恒温摇床振荡增殖培养过夜 3 2 SDS 碱裂解法制备质粒 1 细菌收集 用微量移液枪各取 1mL 两种菌液至 1 5ml EP 管内做好标记 6 000 rpm 离 心 3min 弃尽上清液 再次取样 1mL 菌液至同一 EP 管内 重复离心 留沉淀 2 细菌裂解 向上述沉淀中加入100 L冰预冷的碱裂解液 强烈振荡混匀 用移液枪 吹打 至菌悬液完全浑浊 加入200 L新配置的碱裂解液 于菌悬液中 盖严 管盖 轻轻颠倒混匀4 5次 但切勿振荡 冰浴约5min 至瓶盖下出现粘稠丝状 物为止 再加入150 L预冷的溶液 盖严管盖 温和振荡数次 冰浴5min 3 提取质粒 10 000rpm 室温离心5min 取上清至一个新的无菌的1 5mL EP管中 4 质粒纯化 向上述上清中加入等体积酚氯仿 1 1 振荡混匀 10000rpm离心5min 上 清转移至另一个EP管中 将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿 振荡混匀 10000rpm离心5min 上清转移至另一个EP管中 向上述上清中加入等体积的异 丙醇 轻微振荡后摇匀 室温静置5min 10000rpm离心10min 去上清 向EP管 中加入70 酒精200 l 盖紧管口 颠倒几次 10 000rpm离心2min 弃去上清 液 在50 烘箱中烘干至沉淀变透明 重复以上操作 再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支 分别标记PUC18 PUC19 5 纯化质粒DNA 将同种纯化质粒的两管混合 加入50 L蒸馏水 并加入2 L 的去除了 DNA酶的RNA酶 20 冰箱保存备用 3 33 3 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1 配胶 称取琼脂糖0 25g放入三角瓶 加25ml电泳缓冲液 在电炉上充分加热溶解 滴加一小滴EB 溴化乙锭 溶液 使溶胶成微红色 摇匀 8 2 制胶 在室温下冷却至65 左右 向放好梳子和挡板的槽内到胶 厚度约0 3cm左 右 待胶体凝固后 小心拔出梳子 将电泳胶放到电泳槽的平台上 加电泳缓 冲液使其刚好浸没胶面 3 加样 分别取获得的质粒DNA 10 L在塑料手套与2 L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲 液 混匀后取10 l上样 同时取5 L DNA Marker上样 4 电泳 以上样槽一端为负极接通电源 调节电压至100V 约20min后 根据溴酚蓝 指示剂的迁移位置 决定是否终止电泳 5 紫外观察 切断电源 取出凝胶 置于紫外透视仪上观察实验结果并拍照 3 43 4 DNA酶切 1 取一离心管 分别加入 5 L 无菌水 2 L10 xBuffer 11 L 质粒 DNA 1 LBamH I 1 L Hand 总体积共 20 L 2 混匀后 离心 5 秒 37 酶切过夜 3 53 5 酶切后产物回收纯化 1 配胶 称取琼脂糖0 3g放入三角瓶 加30ml电泳缓冲液 在电炉上充分加热溶解 滴加一小滴EB 溴化乙锭 溶液 使溶胶成微红色 摇匀 2 制胶 在室温下冷却至65 左右 向放好梳子和挡板的槽内到胶 厚度约0 3cm左 右 待胶体凝固后 小心拔出梳子 将电泳胶放到电泳槽的平台上 加电2 L 泳缓冲液使其刚好浸没胶面 3 加样 分别取获得的质粒DNA 20 L在塑料手套与4 L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲 液 混匀后上样 同时取5 L DNA Marker上样 4 电泳 9 以上样槽一端为负极接通电源 调节电压至100V 约20min左右 3 63 6 酶切载体pUC 18 与bop基因的连接反应 1 取一离心管 分别加入 2 L酶切pUC 18 15 L酶切外源基因片段 1 L T4 连接酶 2 L10 T4 连接酶 Buffer 总体积共20 L 2 混匀后 离心5秒 置于16 恒温水浴箱内静置过夜 3 73 7 CaCl2制备感受态细胞 1 活化菌种 从接有大肠杆菌DH5 的LB平板上挑取单菌落 接种到含 5ml LB培养基的无菌试管中 37 250rpm恒温摇床中震荡过夜 2 扩大培养 取1 L菌液转移到装有5ml LB培养基的试管中 1 50 37 250rpm恒温摇床培养3h 3 将活化好的菌种与冰水混合物中放置10min 取1ml菌液置于1 5ml无菌 离心管中 4 4000rpm离心5min 倒掉上清 4 在上述沉淀中加入800 L冰预冷的0 1mol L的CaCl2 已灭菌 用移 液器吹打悬浮菌体 5 重复上述两个步骤 6000rpm离心5min 去上清 收集菌体 再加入 100 L冰预冷的0 1mol L的Call2 已灭菌 重悬细胞 于 20 冰箱放置备 用 2 2 8质粒DNA的转化 1 从 20 冰箱中取出感受态细胞 200 1 移取50 1置于空离心管中 再加入20 l连接产物 温和混匀 2 先室温静置30min 再冰浴静置lO 30min 然后 42 静置水浴热激 90s 立即移置冰浴中 放置30min使之冷却 3 分别取100 l转化菌液均匀涂布于3个事先制备好的氨苄青霉素 0 1g ml LB琼脂平板上 并以50 1感受态细胞涂布3个平板作为对照组 4 将平板正向放置在37 恒温培养箱1h 直到表面液体都渗到培养基后 再倒置培养过夜后观察 3 8 PCR扩增目的基因 1 依次向PCR反应管中加入无菌水20 5 l 10 xPCR buffer 2 5 l 20mmol L 4种dNTP混合液 0 5 l 20 mol L正向引物 0 5 l 20 mol L负向引物 0 5 l 1 2 lTapDNA聚合酶 0 5 l 模板DNA 1 l 10 总体积25 l 以上试剂均事先在冰箱中冷藏保存 2 充分混匀后 将PCR反应管放置在PCR仪的加热板上 3 梯度 PCR 按下列条件扩增 先 95 变性 5 min 再按如下参数循环 30 次 94 变性 30s 60 退火 30 s 72 延伸 1min30s 最后 72 保温 5min 4 PCR 回收产物检测 按照 2 2 3 称取琼脂糖 0 2g 放入三角瓶 加 20ml 电泳缓冲液配胶 制胶 取 10 lPCR 产物和 2 l 6x1000 loading buffer 混合液 10 l 上样 同时取 5 L DNA Marker 上样 观察电泳后结果并拍照 3 4 4 结果与讨论结果与讨论 4 14 1 实验结果实验结果 4 1 1 pUC18和pUC19 bop质粒DNA电泳鉴定 提取含pUC18和pUC19 bop两种质粒DNA 蒸馏水溶解 RNA消化酶处理 经 1 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶成像系统成像 与DNA Marker相比较 两种质粒 DNA在1200bp到2000bp之间均有一条清晰明亮DNA条带 图1 1 2 3 4 5 6 7 M bp 11 2000 1000 0 图1 pUC18质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 M DL2000Marker 1 7 pUC18质粒DNA 4 1 2 pUC19 bop质粒PCR扩增产物电泳鉴定 从pUC19 bop质粒经PCR特异性扩增目的基因bop 经1 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶成像系统成像 与DNA Marker相比较 在1000bp到2000bp之间有一条明 显特异性条带 与预期大小1200bp相符 初步确定此处为PCR扩增得到的含bop 基因片段 在100bp处有条带出现 初步推断此处PCR扩增体系中的引物 图2 1 2 3 4 5 6 7 8 M bp 12 2000 1200 0 图2 bop基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 M DL2000Marker 1 8 PCR扩增产物 4 1 3 克隆载体pUC18酶切产物电泳鉴定 将克隆载体pUC18Hand 酶切 经1 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶成像系统成 像 与DNA Marker相比较 孔上样孔在2000bp之上有一条带 与预期大2656bp 相符 可以初步确定此处为此处为pUC18经Hand 酶切后质粒DNA 图3 电泳条带清晰 无拖尾和污染出现 说明经酶切的克隆载体pUC18及目的片段可 用于下一步于载体连接 13 2000 图3 克隆载体pUC18及bop基因片段琼脂糖凝胶电泳结果 M DL2000Marker 2条光带为酶切后的pUC18 4 1 4 重组质粒的制备及抗性筛选 目的片段和pUC18 Hand 酶切后 用T4DNA连接酶16 静置过夜后 转化到 大肠杆菌DH5 感受态细胞 转化产物在Amp 的LB平板上 设计空白 阳性和阴 性对照组 37 培养过夜 只有转化质粒在Amp 的LB培养基上有菌落形成 14 图 4 导入重组质粒的感受态细胞 图 5 感受态细胞 4 1 5 重组质粒的PCR鉴定 挑取阳性重组转化子白色菌落 在含有0 1g ml氨苄青霉素的5m1 LB液体培 养基培养过夜 小量提取质粒DNA 另取小量菌液做PCR扩增反应 将提取到的 重组质粒DNA及PCR扩增产物经