兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性

兔兔 VX2VX2 肿瘤的离体培养及有关生物学特肿瘤的离体培养及有关生物学特 性性 1 1 目的 在体外分离纯化 VX2 肿瘤细胞 观察其生物学特性 方法 采用组织 块法和消化法结合对兔 VX2 肿瘤进行原代培养 体外传代观察 传代 40 次并对培 养细胞进行形态 学观察 细胞周期检查 核型分析 兔及裸鼠移植 结果 纯 化的兔 VX2 肿瘤细胞形态一致 呈圆形 多角形的上皮细胞 体积小 核浆比倒 置 体外连续培养 8 mo 传代 50 次以上 细胞倍增时间为 26 4 h 细胞周期测定 G1 期为 74 61 G2 期为 7 78 S 期为 17 6 染色体为亚三倍体核型 众数为 60 条 高细胞浓度可保证同种移植成瘤率 裸鼠移植可成瘤 无支原体污染 结论 兔 VX2 肿瘤细胞系来源于 Shope 病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞 恶性肿瘤 目前已经纯化 可应用于进一步肿瘤实验研究 关键词 兔 肿瘤细胞 培养的 肿瘤标记 生物学 0 0 引言引言 兔 VX2 肿瘤是来源于 Shope 病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤 属于鳞状细胞癌 1940 年建株 1 国内文献对其来源描述不统一 其特点 可接种在兔体内 具有较高的肺 肝转移特性 在大型动物模型的研究上具有 很高的应用价值 国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的 VX2 细胞系 多 数仍以组织块方法保存 为进一步进行离体研究 我们分离并纯化了 VX2 瘤株 并进行了生物学特性观察 1 1 材料和方法材料和方法 1 1 材料新西兰大白兔 9 只和 BALB c 裸鼠均购自第四军医大学实验动物中 心 原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块 于新西兰大白兔 腿部肌肉内接种并增殖 胎牛血清 FBS Gibco 培养瓶 Costar RPMI 1640 Gibco 24 孔板 Nunc Roskilde Denmark 广谱抗细胞角蛋白 PCK 混 合型鼠抗兔 mAb Boster 广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪 mAb 福州迈新公司 秋水仙素 西安山川公司 离心机 LD52A 北京医用离心机厂 其他试剂及 仪器取自唐都医院中心实验室 1 2 方法 1 2 1 肿瘤细胞的分离纯化无菌摘取 VX2 肿瘤边缘增殖活跃部分 用 PBS 液 冲洗 3 次 在显微镜下剔除多余组织 剪成直径 0 5 1 0 mm 左右的小块 以 2 5 g L 胰酶加 1 g L 胶原酶于 37 消化 20 min 200 目尼龙网过滤后 800 r min 离心 5 min 取沉淀物培养 较低密度接种于 6 孔板 组织块贴壁接种于 预先涂抹薄层 FBS 的培养瓶 Costar 瓶底 瓶底朝上 向瓶内加入含 100 mL L FBS 和青链霉素双抗的 RPMI 1640 培养液 5 mL 置 37 50 mL L CO2 饱和湿度的培养箱内 2 h 后缓慢将培养瓶翻转 消化法第 2 日即见细胞生长 组织块法于第 3 日组织块均浮起 可见细胞生长 于岛状生长的细胞处在倒置 显微镜下无菌刮取 培养 取得多瓶纯化细胞 其形态 生长速度基本一致 待细胞成片生长 占据大部分瓶底时即用 2 5 g L 胰蛋白酶于 37 下消化传代 1 2 2 形态学观察分别取纯化后第 10 代和 50 代的细胞进行细胞爬片 HE 染色 倒置显微镜镜下观察 将 VX2 瘤接种于兔腿部肌肉 待成瘤后切片光镜 下观察 1 2 3 生长特性测定将第 50 代细胞以 1 107 L 的密度接种于 24 孔板 每 孔加入含 100 mL L FBS 的 1640 培养基 0 5 mL 置细胞培养箱中培养 每日同 一时间用胰蛋白酶消化 3 孔细胞 血球计数板进行计数 连续进行 4 d 绘制 细胞生长曲线 利用 SPSS 软件指数函数拟合模型 Exponential 辅助计算细胞 群体倍增时间 2 制作细胞爬片 分别于贴壁后 24 48 72 h 计算分裂指 数 1 2 4 琼脂集落形成率测定收集第 52 代细胞和相应的对照细胞 制备含细 胞的 3 5 g L 琼脂糖液 并加到 7 g L 琼脂糖凝胶上 于 37 50 mL L CO2 饱和湿度条件下培养 3 wk 后计算集落形成率 1 2 5 免疫细胞化学分析取第 55 代细胞爬片 室温下用 1 1 混合的甲醇 与丙酮将生长在盖玻片上的细胞固定 15 20 min 分别应用 PCK 混合型鼠抗兔 mAb 及超敏加广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪 mAb 行免疫组织化学染色 光学显微 镜下观察 1 2 6 染色体分析取处于 80 汇合时的第 60 代细胞加入终浓度为 0 3 mg L 的秋水仙素 在 37 50 mL L CO2 饱和湿度的培养箱中孵育 5 h 然后尽量 吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁 将细胞悬液装入 10 mL 离心管 1100 r min 离心 10 min 去上清液 再向离心管中轻轻加入 6 mL 低渗盐溶液 75 mmol L KCl 37 静置 30 min 然后加入 2 mL 新鲜固定液 甲醇 冰乙酸 3 1 预固定 用移液管吹打调匀 1100 r min 离心 10 min 去上清液 之 后加入新鲜固定液 8 mL 轻轻吹打均匀 离心 10 min 本步骤再重复 2 遍 末 次离心后 小心吸除大部分上清液 余下 0 5 1 0 mL 固定液 轻轻吹打调匀 吸少量细胞悬液 滴落在 20 预冷过的洁净载玻片上 迅速在酒精灯火焰上烤 干 制备好的玻片立即用 Giemsa 染色 显微镜下观察染色后的标本 统计其染 色体数目 作者 苏畅 张惠中 李文海 林芳 梁晓华 江吕泉 程庆书 关键词 肿 瘤细胞 Culture in vitro and related biolog 本篇论文是由 3COME 文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站 的 论文版权属原作者 请不用于商业用途或者抄袭 仅供参考学习之用 否 者后果自负 如果此文侵犯您的合法权益 请联系我们 1 2 7 细胞周期测定用 2 5 g L 胰蛋白酶加 0 25 g L EDTA 消化培养细胞 确保细胞尽可能打散 PRM 1640 重悬后移至 1 5 mL 离心管中 PBS 离心清洗 3 遍后 加入 DPBS Dulbeccos phosphate buffered saline 配制的 750 mL L 冰乙醇 4 固定 2 h 或过夜 PBS 再离心清洗 1 遍后用 1 g L RNase 37 消化 20 30 min DPBS 离心清洗 2 遍 300 目尼龙网过滤 0 2 0 3 mL DPBS 重悬 PI 染色 5 min 后流式细胞仪测定细胞周期 1 2 8 同种异体移植取第 60 70 代的对数生长期细胞 将新西兰兔分为 3 组 每组 3 只 分别以 1 109 1 1010 1 1011 个 L 的细胞悬液 4 mL 接种 于兔腿部肌肉 观察肿瘤在肌肉内的生长情况 1 2 9 裸鼠移植取第 60 70 代对数生长期细胞 2 1011 个 L 接种于 3 只 BALB c 裸鼠腋窝皮下 每只 1 mL 观察肿瘤在肌肉内的生长情况 1 2 10 支原体及致高钙血症能力检测采用地依红染色及肉汤培养法检测培 养液及细胞内支原体 对成功接种 VX2 瘤的兔子进行耳缘静脉采血 检测血清 钙离子浓度 3 4 1 2 11 细胞系的维持 冻存与复苏取对数生长期细胞 用 DHanks 液漂洗 3 遍 2 5 g L 胰蛋白酶加 0 2 g L EDTA 消化细胞 5 min 收集细胞 800 r min 离心 5 min 用 1640 培养液重悬细胞 每瓶细胞分种 3 5 瓶 同时冻存 适量细胞 冻存液为培养液中加入 100 mL L 血清及 80 g L 二甲基亚砜 放入 液氮罐中保存 将盛有 VX2 细胞的冷冻管 已冷冻保存 1 mo 从液氮中取出 37 水浴 使细胞迅速融化 将细胞悬液移入预温至 37 含有 100 mL L 血 清的 1640 培养液中 置于 37 50 mL L CO2 及饱和湿度的培养箱中培养 细 胞的成活率大于 80 2 2 结果结果 2 1 细胞形态最初纯化的细胞部分在相差显微镜下可见扇形细胞质 fanlike membranes 图 1 经过一段时间传代 细胞呈上皮样细胞排列 单层贴壁生长 有铺路石征 生长成团后即出现重叠生长现象 细胞以多边形为 主 图 2 HE 染色见细胞轻度嗜碱 核大 核质比例异常 细胞呈异型性明显 可见较多核分裂象 图 3 2 2 生长特性细胞生长于第 3 日达到高峰 细胞倍增时间为 26 4 h 第 55 代细胞的生长曲线见图 4 细胞分裂指数分别为 24 h 1 9 48 h 7 0 72 h 9 3 双层琼脂形成率为 22 1 图 1 倒置显微镜下兔 VX2 肿瘤细胞呈扇形细胞质 400 略 图 2 传代后倒置显微镜下兔 VX2 肿瘤细胞呈多边形为主 100 略 图 3 兔 VX2 肿瘤细胞形态 100 略 2 3 免疫组织化学染色细胞胞质中可见到 PCK 免疫组织化学染色弱阳性 波纹蛋白染色阴性 2 4 染色体分析在 100 个分裂中期细胞中 染色体数目主分布于 57 62 之 间 染色体众数为 60 多为亚三倍体 染色体有缺失 断裂 易位等结构异常 2 5 细胞周期分析流式细胞仪分析结果显示 G0 G1 74 61 G2 M 7 78 S 17 6 G2 G1 1 87 DI 2 40 图 4 第 55 代细胞的生长曲线 略 2 6 同种异体移植及裸鼠移植以 1 109 个 L 细胞密度接种的 3 只兔子均未 成瘤 以 1 1010 个 L 接种的有 2 只成瘤 其中 1 只于 3 wk 后停止生长 解 剖后可见瘤体基本为豆渣样坏死 以 1 1011 个 接种的有 2 只成瘤 3 只成功 成瘤的兔子成瘤潜伏期约 10 d 分别于 36 38 45 d 后衰竭死亡 解剖后可 见瘤体无包膜 呈侵润性生长 中心豆渣样坏死 多有大量脓血 广泛转移 与传统组织块接种法成瘤特点一致 3 只裸鼠均成瘤 图 5 图 5 兔 VX2 细胞裸鼠移植 可见后肢皮下有成瘤现象 略 2 7 支原体及致高钙血症能力检测支原体检测阴性 动物在接种后 1 wk 化 验血钙波动在 2 1 2 5 mmol L 之间 3 3 讨论讨论 兔 VX2 肿瘤是世界上广泛使用 可在大型动物体内生长的恶性肿瘤 常用 于恶性肿瘤介入和射频治疗的研究 3 5 及影像学研究和动物模型的建立 6 7 其优越性是小型实验动物肿瘤模型所无法比拟的 国内经常采用部位命名 法来命名 VX2 肿瘤 如兔 VX2 肝癌 却忽视了 VX2 瘤是乳头瘤恶变而成的上皮 来源的恶性肿瘤 国外对于体外 VX2 细胞系的建立一直有争议 Osato 等最早 与 1967 年体外培养的 VX2 细胞由于培养箱故障而丢失 8 Voelkel 等 9 建立了一株 VX2 细胞系 活力成瘤能力低 并且丧失了产生 PGE2 的能力 没有 受到公认 1982 年 Easty 等 10 建立了 VX2 细胞系 与此同时瑞士的 Rolf 等也建立了该细胞株 并与之有差异 而比较结果没有报道 细胞系也没有广 泛应用 1985 年 Georges 等 11 发现了 2 种不同的 VX2 瘤株 一种 VX2R 高 表达角蛋白 仅能在裸鼠体内成瘤 另一种 VX2R 低表达角蛋白 成瘤能力强 Dabbous 等 12 1980 年也曾发现 3 种形态不同的 VX2 细胞 刘险峰等 13 纯化了一株高表达角蛋白 高成瘤能力的 VX2 瘤株 本实验纯化的 VX2 瘤株形 态学上与文献 8 10 11 的报道结果相似 致高钙血症能力检测 与 Doppelt 等 14 15 的结果相同 从角蛋白表达低 接种后兔存活期短来看 恶性程度 比较高 但是成瘤能力较国内一些研究较弱 我们还发现接种后有个别肿瘤自 发性衰退的现象 与 Osato 等报道的 VX7 瘤自发性衰退相似 结合本实验和国 外的文献报道 考虑 VX2 自身可能发生一定程度的分化 这可能与 VX2 瘤在国 内外多以冰冻组织块法保存有关 发生自发性衰退和恶性程度减低的细胞必然 在传代的过程中淘汰 因此怀疑 VX2 的恶性程度略有增高的可能性大 但是 VX2 肿瘤的基本性质没有变化 仍然是一株具有很高实用价值的应用与大型实 验动物的肿瘤细胞 1988 年 VX2 瘤株从日本传入我校以来 一直主以液氮冷冻 组织块和动物体内传代结合的方法保存 为进行进一步体外研究 我们纯化了 该细胞系 经过长时间传代 性质稳定 可用于体外实验 实验中发现的低细 胞数量下成瘤能力下降和自发性消退现象 其原因尚需进一步研究 参考文献参考文献 1 Kidd JG Rous P Cancer deriving from virus papillomas of wild rabbits under natural conditions J J Exp Med 1940 71 4 469 494 2 严泉剑 李六金 张宇梅 等 生长曲线拟合及细胞群体倍增时间 的简化计算 J 第四军医大学学报 2002 23 10 293 3 Rhee TK Larson AC Prasad PV et al Feasibility of blood oxygenation leveldependent MR imaging to monitor hepatic transcatheter arterial embolization in rabbits J J Vasc Interv Radiol 2005 16 11 1523 1528 作者 苏畅 张惠中 李文海 林芳 梁晓华 江吕泉 程庆书 关键词 肿 瘤细胞 Culture in vitro and related biolog 本篇论文是由 3COME 文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站 的 论文版权属原作者 请不用于商业用途或者抄袭 仅供参考学习之用 否 者后果自负 如果此文侵犯您的合法权益 请联系我们 4 Eivazi B Sapundhziev N Folz BJ et al Bipolar radiofrequency induced thermotherapeutic volumetric reduction of VX2 metastases in an animal model J In Vivo 2005 19 6 1023 1028 5 Haaga JR Exner AA Wang Y et al Combined tumor therapy by using radiofrequency ablation and 5FUladen polymer implants Evaluation in rats and rabbits J Radiology 2005 237 3 911 918 6 Sapundzhiev N Dunne AA Ramaswamy A et al The auricular VX2 carcinoma Feasibility of complete tumor resection J Anticancer Res 2005 25 6B 4209 4214 7 Maruyama H Matsutani S Saisho H et al Sonographic shift of hypervascular liver tumor on blood pool harmonic images with definity Timerelated changes of contrastenhanced appearance in rabbit VX2 tumor under extralow acoustic power J Eur J Radiol 2005 56 1 60 65 8 Osato TT Ito Y In vitro cultivation and immunofluorescent studies of transplantable carcinomas Vx2 and Vx7 J J Exp Med 1967 126 5 881 886 9 Voelkel EF Tashjian AH Jr Franklin R et al Hypercalcemia and tumorprostaglandins The VX2 carcinoma model in the rabbit J Metabolism 1975 24 8 973 986 10 Easty DM Easty GC 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