限制性核酸内切酶消化DNAppt课件.ppt

实验二限制性核酸内切酶消化质粒DNA 一 实验目的 1 掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法 2 了解酶切反应条件 二 实验原理 限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定核苷酸序列 并在识别位点内或附近切割双链DNA的核酸内切酶 在一定条件下 如合适温度 盐浓度等 它能在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双链DNA分子断开 类酶切割位点在识别序列中 有的在对称轴处切割 产生平末端的DNA片段 如Sma 5 CCC GGG 3 有的切割位点在对称轴一侧 产生带有单链突出末端 3 突出和5 突出的单链末端 的DNA片段称粘性末端 如EcoR Hind 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端 二 实验原理 EcoR Hind 质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子 本实验用到的是pGEM TEasy质粒 二 实验原理 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA 也可以分离相对分子质量相同 但构型不同的DNA分子 质粒有3种构型 1 超螺旋的共价闭合环状质粒DNA 2 开环质粒DNA 即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂 3 线状质粒DNA 即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同 因此电泳后呈3条带 超螺旋质粒DNA泳动最快 其次为线状DNA和开环质粒DNA 二 实验原理 EcoR 或Hind 可以将pGEM TEasy质粒DNA切开成为线性DNA 用未经酶切的pUC质粒DNA为对照 通过电泳迁移率的比较 就可以推测酶切是否成功 二 实验原理 Marker12 图片说明 1未经酶切的质粒DNA2经EcoR 或Hind 酶切后的线性DNA和目的DNA 3000bp 2000bp 1000bp 600bp 500bp 目的DNA 三 仪器与试剂 主要仪器 恒温水浴箱 离心机 电泳槽与电泳仪主要试剂 限制性核酸内切酶 EcoR Hind 10 酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液0 5 TBE缓冲液质粒DNA 四 实验步骤 1 建立反应体系 0 5mL无菌的EP管 总体积20 L 2 37 水浴1h 3 低速短暂离心 4 加4 L上样缓冲液于离心管中混匀 1 琼脂糖凝胶电泳 100V 40min 取12 L点样 无菌双蒸水12 L质粒2 L10 buffer酶切缓冲液2 L内切酶EcoR 4 L 轻轻混匀 低速短暂离心 质粒酶切电泳图 五 实验结果 六 注意事项 1 操作时注意 1 分子生物学实验多为微量操作 注意吸样量的准确性 2 要求在冰上操作 并充分混匀 3 打开EP管时 手不要接触到管盖内面 以防污染 4 水浴时 将EP管盖严 以防水进入管内 六 注意事项 2 内切酶的使用时注意 1 不使其污染与浪费 2 注意加样顺序 3 注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1 10 避免星活性 产生星活性的原因 高甘油含量 酶量过大 低离子强度 高pH 8 0 含有有机溶剂 非Mg2 的二价离子存在 六 注意事项 3 质粒DNA对结果的影响 作为内切酶底物 DNA应该具备一定的纯度 其溶液中不能含酚 氯仿 乙醚 SDS EDTA 高盐浓度 酒精等 这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力 这种抑制作用可通过下列方式克服 1 增加酶作用单位数 10 20U ugDNA 2 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 3 延长反应时间 4 反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由Tris HCl NaCl Mg2 组成 其中Mg2 为内切酶辅基 Tris HCl维持反应体系pH值在7 2 7 6之间 NaCl浓度不同形成 种级别的离子强度 低盐 10mMNaCl 中盐 50mMNaCl 高盐 100mMNaCl 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液 六 注意事项 5 酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度 是影响限制内切酶活性的一个重要因素 不同的核酸内切限制酶 具有各自的最适反应温度 多数限制内切酶的最适反应温度是37 少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37 六 注意事项 6 酶切消化反应的时间 反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定 原则是DNA 酶 本实验1小时即可充分酶解 六 注意事项 7 限制性内切酶反应的终止 通常有以下两种方法 1 采用65 条件下温浴20min 通过加热失活内切酶 2 加终止反应液 如0 5mol L