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肿瘤病毒学（肿瘤病毒病因）,肿瘤学研究生课程2002年5月,医学全在线 ,总 论,凡能在人或动物引起肿瘤或在体外能使细胞恶性转化的病毒都称为肿瘤病毒。,肿瘤病毒与人类肿瘤,研究历史：1908年 Ellerman和Bang用鸡白血病的无细 胞滤液感染鸡，鸡可发生白血病1911年 Rous用可过滤因子成功地诱发了鸡 的肉瘤。1947年Claude等观察到病毒 颗粒, 命名为Rous肉瘤病毒,Rous肉瘤病毒是第一个被证实的肿瘤病毒。 对于肿瘤病毒与宿主细胞相互关系的研究，逆转录酶的发现和第一个癌基因(src基因)在病毒基因中的定位等, 都是在这一系统中研究获得的具有重要意义的结果。,Shope肉瘤病毒,1933年Shope将病毒所致的野兔乳头状瘤进行皮下移植试验，发生浸润性鳞癌，并证明兔粘液瘤、纤维瘤和乳头状瘤均由病毒引起，称为Shope肉瘤病毒。两年后Bittner首次证明含有致瘤病毒的乳汁可将鼠乳腺癌传给子代。,60年代后又陆续发现许多病毒可以引起肿瘤，包括大部分 DNA病毒均能在一定条件下引起肿瘤。如人类的腺病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒等。,EB病毒（Epstein Barr virus)与人类的两种肿瘤，Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌有密切关系。1962年Burkitt从流行病学调查和地理流行病学分析，认为东非儿童中高发的特殊类型的淋巴瘤可能与传染因子有关。1964年Epstein和 Barr在淋巴瘤细胞培养液中发现病毒，命名为EB病毒。,1908年Ellerman和Bang发现自发性鸡白血病的无细胞滤液能感染鸡并引起白血病。 1951年Gross分离出小鼠白血病病毒，并陆续报道了病毒引起的大鼠、豚鼠、猫、狗、猴白血病。,70年代初在日本特别是南部沿海湿热地区，成人T细胞白血病(ATL)高发，Miyoshi等人从一例男性ATL病人外周血与脐血共培养建立了MF-1细胞株。1979年Hinuma等人在这株细胞中观察到新的C型RNA病毒，称成人T细胞白血病病毒（ATLV）。,与此同时美国NIH的Gallo等人从皮肤型T细胞白血病病人外周血建了CTC-2细胞株， 分离到人类T细胞白血病病毒（HTLV），与ATLV在免疫学和分子杂交方面相同。 1983年在美国冷泉港举行的T细胞白血病病毒会上，将此两种病毒命名为HTLV-I。,1982年从美国西雅图1例毛细胞白血病病人脾建立的细胞中分离出C型病毒，其核心抗原P24与HTLV-1不同，但具一定同源性，故称HTLV-II。,1980年法国巴斯德研究所从一例淋巴腺病综合症(LAS)病人分离到1株新的逆转录病毒，命名为淋巴腺病综合症相关病毒(LAV)。同时Gallo实验室也报道分离出类似病毒，称HTLV-。研究表明LAV / HTLV- 与人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关。国际病毒命名委员会将此两种病毒定名为免疫缺陷病毒（HIV）,属逆转录病毒中的慢病毒科。,病毒的基本特点：,1、体积微小，以nm计算，能通过细菌滤器， 用电镜观察；2、非细胞结构：无包膜病毒仅由一种核酸和 一个蛋白质外壳组成；3、基因组：RNA或DNA4、严格细胞内寄生；5、以复制方式繁殖；6、对抗生素不敏感。,肿瘤病毒的特征,1、诱发肿瘤： 在实验条件下，有的肿瘤病毒能在同一动物引起多种肿瘤，如多瘤病毒可使小鼠产生23种不同部位和不同组织类型的肿瘤；有的肿瘤病毒可使多种动物发生肿瘤，如鸡肉瘤病毒不仅诱发禽类的肿瘤，也可诱发哺乳动物发生肿瘤。,2、传播方式: 肿瘤病毒可以在动物界以潜伏状态广泛存在，通过直接接触感染或通过胎盘、乳汁感染子代。病毒诱发肿瘤与很多因素有关，如宿主的遗传特征、性别、内分泌状况、免疫状态、年龄以及病毒的致癌强度等等。,3、细胞转化： 肿瘤病毒在体外能使正常细胞转化， 转化细胞的特征与体内肿瘤细胞相似。肿瘤病毒在细胞内存在的形式：（1）完整病毒（2）仅有核酸，不能合成病毒外壳（3）仅有核酸，或部分核酸片段与细胞 核酸整合，不能产生完整病毒,肿瘤病毒感染宿主细胞的方式,1、增殖性感染（productive infection): 又称裂解性感染（lytic infection),肿瘤病毒感染宿主细胞后, 病毒基因可充分表达，病毒繁殖、复制，产生感染性子代 细胞裂解、死亡。,2、非增殖性感染(non-productive infection)： 肿瘤病毒在细胞内复制率很低或完全不复制，但病毒核酸整合与细胞染色体上，使细胞发生遗传性改变即转化，细胞转化后可获得无限生长的特性，因为肿瘤病毒在某一阶段被阻断，所以并非所有的病毒基因均能表达。,细胞感染病毒后的变化,1、病毒繁殖：引起细胞裂解死亡，导致 损害性疾病，多为急性； 2、整合：病毒核酸整合于细胞核酸中，使 细胞发生遗传性改变，即转化， 导致增生性疾病，发生肿瘤。,细 胞 转 化 的 特 点,1、形态与行为的改变： a. 梭形细胞圆化、增大、母细胞化； b. 对附着体的粘着力减弱，细胞相互间的走 向失去正常规律性，失去接触抑制，细胞 重叠生长，可以悬浮生长，软琼脂生长(集 落形成)，微肿瘤样的细胞灶斑； c. 生长时减少对血清成分的需要，糖原酵解 获得能量。,2、细胞表面结构变化： 糖运送加快，透明质酸成分增加，失去胞浆 微丝状物，出现胚胎抗原或病毒相关抗原等；3、非表面性的生化改变： 如释放蛋白酶类，胚胎基因再行活化，激素 产生异常等。4、若真正发生肿瘤原性转化，接种到适合的动物 宿主可形成肿瘤。,研究人类肿瘤病毒病因的技术方法,1、细胞培养：（1）建立肿瘤细胞株：研究细胞内是否有病 毒或病毒的痕迹；（2）细胞转化试验：鉴定分离的病毒是否具 有致肿瘤的特性，如人EBV能使正常人 的B淋巴细胞转化成类淋巴母细胞，转 化细胞带有病毒基因，可连续传代。,（3）细胞融合：将带有病毒基因而无完整病毒的T 细胞，在灭活的仙台病毒作用下与 敏 感 细胞融合成杂交细胞，这样可去除T细胞内对病毒基因的抑制作用，从而复活T细胞内的病毒。 （4）药物激活肿瘤病毒：嘧啶类似物(正丁酸、TPA)可激活T细胞中的肿瘤病毒,2. 用无胸腺小鼠建立人类肿瘤的移植瘤株,如用无胸腺小鼠建立了人鼻咽癌的移植瘤株，该细胞株有EBV抗原和核抗原，移植瘤株的体外培养物有EBV颗粒出现，或较纯的上皮癌。,3、电镜观察：如EBV首先是用电镜在癌细 胞株中发现的；4、血清学方法：如CF，NT, IFA, 免疫扩散， 免疫电泳，放射免疫等；5、流行病学方法：血清流行病学调查，研 究病毒与肿瘤的关系；,6、分子生物学与生物化学技术：如核酸杂 交法发现鼻咽癌上皮细胞和鼻咽部非癌 细胞有EBV基因；7、疫苗试用：阻断作用。拟用EBV疫苗，预 防和控制非洲儿童Burkitt淋巴瘤，是否 可预防EBV感染和降低鼻咽癌发病率？,确定病毒致癌作用必须具备以下五个条件：,1、病毒感染在肿瘤发生之前；2、在肿瘤内找到病毒或病毒抗原；3、体外培养的瘤细胞能产生相应病毒的抗原；4、病毒能使正常细胞转化为恶性细胞，并能在实 验动物中诱发癌瘤；5、用免疫措施预防病毒感染能降低肿瘤的发生率。,根据肿瘤病毒基因组核酸的不同，可以分为两大类：,1. DNA肿瘤病毒2. RNA肿瘤病毒,DNA肿瘤病毒主要包括：,乳多空病毒（Papovaviridae)： 乳头瘤病毒（Papilloma virus) 多瘤病毒（Polyoma virus) 空泡病毒（Vaculating virus) 腺病毒（Adenoviridae)：部分病毒 疱疹病毒（Herpesviridae)：部分病毒 乙性肝炎病毒 痘病毒,多瘤病毒是Gross于1953年从小鼠分离出来的，由于它能诱发小鼠产生多种肿瘤，故命名为多瘤病毒。猴病毒40（Simian virus 40，SV40）是多瘤病毒科中的重要成员，它是60年代在研究脊髓灰质炎疫苗时无意中发现的。,1971年又相继分离到两种人多瘤病毒：BKV和JCV。其中BKV是从免疫抑制治疗的肾移植患者的尿中分离的，而JCV则是从进行性多发脑白质病（progress multifocalleukoencephalophathy, PML)患者的脑组织中分离获得的。,现已证实EB病毒可以诱发人鼻咽癌，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)与人宫颈癌有关，1997年还发现人疱疹病毒8型(HHV-8)，即Kaposi氏肉瘤相关疱疹病毒( Kaposis sarcoma-associate herpesvirus, KSHV）能通过感染骨髓树突状细胞（ dendritic cell)，而引起性质未明的单克隆珠蛋白病(mono-clonal gammophathy of undetermined significance, MGUS)，并能够使MGUS发展为多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM).,RNA肿瘤病毒,与人类、禽类和哺乳动物有关的RNA肿瘤病毒主要是逆转录病毒。 根据电镜下病毒形态分为A、B、C、D四种类型，与肿瘤有病因学联系的逆转录 病毒主要是C型，其次是B型，A型可能是B、C型的不成熟形式，D型病毒是从恒河猴乳癌中分离的，目前还未证明其致瘤作用。,思 考 题：,1、肿瘤病毒是按照什么分类的？2、如何确定病毒与肿瘤的关系？ 3、肿瘤病毒转化细胞的特点？ 4、病毒感染宿主细胞时，增殖性 感染和非增殖性感染的概念,各 论,DNA肿瘤病毒,（一）腺病毒,腺病毒粒子为正二十面体，直径65-80 nm，由252个壳粒组成。 腺病毒能转化细胞，并能使某些动物致癌。目前已发现了102个不同血清型的腺病毒，在人类、猴、鼠类、火鸡中都可以检查到腺病毒的存在。,腺病毒科包括两个属：,1、哺乳动物腺病毒属：代表种是人腺病毒 C。人腺病毒分为6个种，即人腺病毒A、 B、C、D、E、F，共有47个血清型。人腺 病毒虽然不引起人类产生癌症，但人腺病 毒A对啮齿动物有很强的致癌性，人腺病 毒B有中度致癌作用。2、禽腺病毒属：,腺病毒粒子的结构,腺病毒引起细胞转化的分子机理,腺病毒能够使细胞转化，病毒DNA可以整合到宿主细胞的染色体DNA上。在腺病毒转化的细胞中，至少包含4种肿瘤（T）抗原，其中E1B编码的19kD细胞表面蛋白可能与腺病毒的肿瘤专一性移植抗原(tumor specific transplatation antigen,TSTA)的免疫应答有关。,1、腺病毒转化作用的基因片段,人腺病毒感染允许细胞 (permissive cell)，如人细胞，一般引起增殖性感染，并且产生杀细胞；但感染非允许细胞(non-permissive cell)，如仓鼠细胞和大鼠细胞，则导致细胞转化。,在非允许细胞中，腺病毒基因组DNA通常被随机整合到细胞染色体DNA的任何位点，这些被整合的病毒基因组DNA有的缺失，有的被特异性地抑制，一些晚期基因通常不表达，因此腺病毒在非允许细胞中失去了复制和杀细胞能力，而获得转化细胞的特性。,2、腺病毒转化基因E1A和E1B的调节功能 及其转化特性：,E1A蛋白的重要功能是反式激活其它病毒基因和细胞基因的转录。E1A蛋白反式激活的靶子位点有两个，一个是病毒基因或细胞基因的启动子TATA box，另一个是SPI转录因子识别和结合的序列GGGGGG，即Gcbox。,E1A蛋白对细胞基因转录的反式激活既有正调节(up-regulation)活性，也有负调节(down-regulation)功能，如细胞的胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase)基因，增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA)基因，热休克蛋70(hsp70)基因转录都受到E1A蛋白的正调节。,E1A蛋白对细胞基因的转录也具有负调节作用，如在具有致癌能力的Ad12转化的细胞，I类主要组织相容性复合体（MHC I）基因的转录受到抑制，而在不具有致癌能力的Ad5转化的细胞中， MHC I 基因的转录却不受影响。后来发现这一抑制作用与E1A蛋白有关。,现在推测E1A蛋白对MHC I基因表达的抑制作用可能有利于恶性细胞或转化细胞逃避机体免疫系统的监视，因为细胞毒T淋巴细胞（CTL）对这些细胞的杀灭需要MHC I提供识别信号。,尽管腺病毒E1A和E1B共同作用能够诱导培养细胞完全转化，但在大多数情况下，单独的E1A基因却只能诱导培养细胞凋亡，E1A的这种作用依赖于E1A蛋白对抑癌基因P53表达的激活。E1B类似于癌基因bcl2，它能够抑制E1A对细胞凋亡的诱导，因为E1B基因编码的55kD蛋白直接阻止了P53的活性，E1B编码的19kD蛋白也可抑制P53下游效应基因的功能，从而导致细胞发生转化。,腺病毒E1A蛋白的转化功能同它结合Rb有关，Rb基因编码的产物为P105。现有人认为家族性视网膜母细胞瘤的发生与Rb基因的缺失密切相关，因此E1A蛋白结合Rb蛋白所诱导细胞转化和肿瘤发生，可能在功能上相似于Rb基因缺失。E1B的kD蛋白直接结合P53，也是腺病毒引起细胞恶性转化的重要原因。,（二）多瘤病毒,多瘤病毒为双链环状DNA病毒，它们可以感染鸟类、啮齿类、兔和灵长类动物，但对某一种病毒而言，则有最适宜的宿主范围，一种病毒通常仅能高效率地感染某一种或某一类宿主，并形成增殖性感染，而对亲缘关系较远的宿主感染效率较低，不能形成增殖性感染。,由于多瘤病毒能够高效率地感染天然宿主或允许细胞，并产生增殖性感染和杀细胞，因而不能转化允许细胞和使天然宿主产生肿瘤，但多瘤病毒在非允许细胞中不会产生增殖性感染和杀细胞，它们能够引起非允许细胞转化，将这些转化细胞注射到实验动物体内，可诱发实验动物产生肿瘤。,多瘤病毒对半允许细胞（semiper-missive cell）的转化能力依赖于宿主细胞所处的状态，它既可以使一部分细胞转化，也可以杀死一部分细胞，而允许细胞只有当感染病毒的增殖因突变或DNA损伤而出现障碍时，才会被转化。,1、病毒粒子的结构,多瘤病毒为20面体对称，无包膜，其病毒粒子直径为45nm，分子量为25x106，病毒外壳由360个主要衣壳蛋白VP1和大约30-60个次要衣壳蛋白，VP2、VP3构成，其内含有单分子的病毒基因组DNA。多瘤病毒基因组DNA呈双链环形，能与宿主细胞的种组蛋白(histone)：H2A、H2B、H3和H4构成微染色体。,2、病毒基因组,SV40和小鼠多瘤病毒基因组DNA约为5000bp，含有早期基因区和晚期基因区，并有一个复制位点，在复制位点附近有调控区（regulatory region）其调控区内包括增强子和启动子序列。病毒早期基因区和晚期基因区的转录是从调控区起始的，二者转录方向相反。,早期基因区以逆时针方向转录，编码合成不同的T抗原蛋白，其中SV40以及人多瘤病毒BKV、JCV编码合成T抗原和t抗原，这些T抗原,SV40基因组结构,RNA肿瘤病毒均为逆转录病毒科（Retroviridae)的成员,这类病毒既能在宿主细胞中繁殖而不中断细胞分裂，也能使动物和人细胞 转化，诱发人和动物致癌，或产生肿瘤，故称为RNA肿瘤病毒（RNA tumor viruses）。劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus, RSV）是1911年由Rous首次发现的RNA肿瘤病毒。,逆转录病毒具有致癌能力和成瘤性，如引起动物产生白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤等。在某些RNA肿瘤病毒甚至还发现了病毒癌基因的存在。,逆转录病毒的共同特点：,能够携带或编码合成逆转录酶（reverse transcriptase, RT) 当病毒感染细胞后，首先以自身基因组RNA为模板，在病毒逆转录酶的催化下合成DNA中间体，称为前病毒或原病毒DNA（provirus DNA)。,其原病毒DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上，并且能够作为细胞基因组的一部分，随着细胞基因组的复制和细胞分裂而传递下去。在宿主RNA聚合酶的作用下，原病毒DNA可以重新转录形成子代病毒基因组RNA。,一、RNA病毒的分类：,1998年国际病毒分类委员会（ICTV）根据病毒基因组结构和核苷酸序列及其相关特性， 将RNA肿瘤病毒亚科分为5个属。,(一）逆转录病毒属,包括外源性病毒(exogenous virus)和内源性病毒(endogenous virus)。 外源性病毒是指在动物之间或细胞之间进行水平传播的病毒。有些外源性病毒的基因组还带有病毒癌基因，如RSV含有src癌基因，MC29含有myc癌基因，AMV含有myb癌基因，AEV含有erbA和erbB两种癌基因。,内源性病毒是指病毒在初次感染机体或细胞后，其基因组被整合到宿主细胞的DNA中，并成为宿主细胞基因组的一部分，即是以原病毒的形式存在，原病毒DNA可通过细胞分裂传递给子细胞。,代表种为：禽白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)其它主要成员有： 劳氏肉瘤病毒 (Rous sarcoma virus, RSV) 禽成髓细胞病毒(Avian myeloblastosis virus, AMV) 劳氏相关病毒(Rous-associated virus, RAV) 禽骨髓胞质瘤病毒(Avian myelocytomatosis virus, MC29) 禽成红血细胞病毒(Avian erythroblastosis virus,AEV),（二）逆转录病毒属,代表种：小鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary virus, MMTV) MMTV能以包括外源性病毒和内源性病毒两种形式存在， 它除了含有病毒必需基因（gag, pol, env）外，还含有一个功能尚不清楚的ORF，但不携带病毒癌基因。,外源性MMYV多发现于高乳腺癌的纯种小鼠（C3H）中，在乳腺组织和乳汁中大量存在，因此MMTV很容易通过乳汁