分子生物学第16讲ppt课件.ppt

三 阻遏蛋白与操作子的相互作用 一 操作子上与阻遏蛋白结合的位点1 lacI基因的表达特点2 lac操作子 lacO 与阻遏蛋白的结合 1 阻遏蛋白与lacO结合的实验证据 2 lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构A DNA内切核酸酶消化实验证明 受阻遏蛋白保护区域位于 5 21 26bp B 阻遏蛋白保护位点C lacO的结构及其与阻遏蛋白的结合性质 3 阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响 1 阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合 2 阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力 RNA聚合酶与的平衡常数从1 9 107增加到2 5 109 3 阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物 阻止转录的起始 4 阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意4 上述模式不一定适用于其他系 二 阻遏蛋白上与操作子结合的位点1 阻遏蛋白单体的结构 1 长头片段 longheadpiece 2 短头片段 3 核心片段 core 4 铰链区 2 阻遏蛋白四聚体的结构3 阻遏蛋白与操作子的结合4 阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用 1 lac系统存在多个操作子 2 阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合 3 阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平 三 阻遏蛋白与操作子的解离1 诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据2 诱导物与阻遏蛋白的结合3 阻遏蛋白与不同DNA的结合 1 不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性 2 细胞内阻遏蛋白的结合位点 3 细胞内阻遏蛋白的存在 四 影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体1 i 突变体2 iS突变体3 it突变体4 i d突变体等位基因互补5 Oc突变体 第四节分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控 一 分解代谢产物抑制1 某些启动子转录的起始需要辅助蛋白质某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶识别位点 35序列 Sextama框 和结合位点 10序列 Pribnow框 需要辅助蛋白质参与转录的起始 最常见的是大肠杆菌对碳源利用有关的一组操纵元 受一种代谢产物激活蛋白 cataboliteactivatorprotein CAP 控制 在葡萄糖存在时保证细菌优先利用葡萄糖 2 分解代谢产物抑制含义 葡萄糖会引起许多操纵元 包括乳糖操纵元 半乳糖操纵元和阿拉伯糖操纵元 表达的阻遏原因 葡萄糖引起cAMP含量下降 使分解代谢产物激活蛋白失活 从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳源的代谢相关酶的表达 二 CAP对启动子的正调控1 cAMP在分解代谢产物抑制中的作用葡萄糖引起cAMP水平下降是分解代谢产物抑制的原因cAMP由腺苷酸环化酶 adenylatecyclase cya 合成cya基因突变体对葡萄糖变化没有反应 2 CAP的作用 1 CAP的结构特征CAP是同源二聚体 由两个22 5KD的亚基构成CAP单体含DNA结合区及转录激活区 2 CAP结合的DNA位点CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序列阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸序列中 TGTGA 该序列可能是识别的必需成分 CAP与有两个 相反的 五核苷酸序列的位点结合最强 因为这样两个单体均可结合DNA 相对于RNA聚合酶的结合位点 CAP可以与不同的DNA位点结合 3 CAP的激活只有当cAMP存在时 CAP才具有活性 4 CAP对转录的激活作用A CAP激活转录的途径直接与RNA聚合酶作用作用于DNA 以某种方式改变其结构以利于RNA聚合酶的结合 B CAP与DNA和RNA聚合酶的作用CAP二聚体结构保证了一个亚基可与RNA聚合酶接触 哪一个亚基以何种方向与DNA结合无关紧要 C CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置 CAP位于启动子内部 如gal 时 可提高闭合复合物向开放复合物的转化速率当CAP位于启动子临近位置 如lac 时 其主要作用是提高最初结合的速率 以形成开放复合物 第四节操纵元的其他调控形式 一 具有双启动子的半乳糖操纵元 一 半乳糖代谢1 半乳糖代谢相关的酶 1 半乳糖激酶 2 半乳糖转移酶 3 半乳糖表异构酶 2 代谢步骤 1 半乳糖 ATP半乳糖1 磷酸 ADP H 2 半乳糖1 磷酸 UDPGluUDPGal 葡萄糖1 磷酸 3 UDPGalUDPGlu总反应 半乳糖 ATP葡萄糖1 磷酸 ADP H 二 gal操纵元1 gal操纵元组成 1 结构基因 galK galT galE 2 调节基因 galR 与结构基因相距很远诱导物 半乳糖galR 突变 造成组成型表达 3 P O位点galOC突变 造成组成型表达 2 gal操纵元的启动子 图8 9 1 galP1转录起始位置 S1 1 转录依赖cAMP CAP功能 葡萄糖不存在时负责gal操纵元的转录 2 galP2转录起始位置 S2 5 转录不依赖cAMP CAP功能 葡萄糖存在时负责gal操纵元的转录 三 cAMP CAP对galP1和galP2的控制1 gal启动子的cAMP CAP结合位点 1 位置 76 47 2 序列特点 图8 10 具有保守性和对称性 2 cAMP CAP对S1转录的激活及对S2转录的阻遏对galP1 有激活作用对galP2 cAMP CAP结合位点离galP2较近 妨碍RNA聚合酶与galP2的结合 四 Gal阻遏蛋白的作用机制1 gal阻遏蛋白的作用位点galOE 位于 60左右galOI 与galOE相距 90bp 2 gal阻遏蛋白可能的作用机制 1 gal阻遏蛋白与galOE结合 可能通过以下途径发挥作用 妨碍了cAMP CAP与其位点的结合或改变cAMP CAP对转录的促进作用 gal阻遏蛋白与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构 两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应 五 gal操纵元双启动子的意义1 半乳糖的双重作用 1 作为细菌的碳源 2 UDPGal是细菌细胞壁的重要前体2 双启动子的作用 1 galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源 2 galP2保证有葡萄糖存在时 细菌可以合成UDPGal 二 阿拉伯糖操纵元 具有双重功能 正调控和负调控 的调节蛋白 一 阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元1 阿拉伯糖调控元 1 三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元araBADaraE araFG E F G编码膜结合蛋白 与阿拉伯糖的结合与转运有关调节基因 araC 2 调控元 由一个调节基因控制几个操纵元的系统 2 araBAD操纵元的组成 1 结构基因araB 编码L 核酮糖激酶araA 编码L 阿拉伯糖异构酶araD 编码L 核酮糖 5 磷酸 表异构酶 2 操纵元结构 图8 11 araC及araBAD各有启动子 但转录方向相反 二 araBAD操纵元的调控 1 araC基因产物及其结合位点 1 araC基因对araBAD正调控的遗传学证据 2 AraC蛋白的2种形式Crep 未结合阿拉伯糖的AraC蛋白Cind 结合阿拉伯糖的AraC蛋白 3 AraC结合位点araO1 110 140 与araPC重叠araO2 265 294 araI 40 78 下游与RNA聚合酶结合位点紧密相连 上游与CAMP CAP结合位点 107 78 紧密相连 2 对araBAD操纵元起调控作用的因素 1 Crep对araBAD及araC的作用A Crep与araO1结合有效阻遏araC基因的转录对araBAD有轻微的阻遏 B Crep与araO2结合与araO2结合的Crep通过与结合在启动子上的其他蛋白质发生相互作用 实现对araBAD的有效阻遏 两种蛋白质之间的DNA形成环状结构 其间插入非螺旋整倍数目的核苷酸将改变两种蛋白质在DNA双螺旋侧面上的位置关系 从而降低阻遏效率Crep二聚体同时结合araO2和araI 实现对araBAD的有效阻遏 2 Cind对araBAD及araC的作用Cind与araI结合激活araBAD基因的转录Cind与araO1结合阻遏araC基因的转录 3 cAMP CAP是araBAD和araC表达的正调控因子 3 araBAD操纵元的调控 图8 12 1 无AraC及cAMP CAP时 araC转录 但很快会被Crep所阻遏 自身调控 2 有AraC 无cAMP CAP时 araBAD和araC均不转录 3 有AraC 阿拉伯糖及cAMP CAP时 araBAD转录 4 Cind和cAMP CAP促进araBAD转录的机制促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成开放性启动子复合物 三 色氨酸操纵元 可阻遏系统 一 trp操纵元的结构1 结构基因及其编码的酶trpE trpD 编码邻氨基苯甲酸合成酶的2个亚基 各为60KDtrpC 编码吲哚甘油磷酸合成酶 分子量为45KDtrpB trpA 编码色氨酸合成酶的 亚基 50KD 和 亚基 29KD 2 前导序列trpO与trpE之间有一段162bp的序列可以转录到mRNA中3 终止子在trpA基因下游36bp处有一个不依赖于 因子的终止子t在t的下游250bp处有一个依赖于 因子的终止子t 4 调节基因调节基因trpR与Trp操纵元相距较远 编码阻遏蛋白 二 Trp操纵元的阻遏调控1 Trp的作用Trp有两方面的作用 1 对已有的酶起反馈抑制 feedbackinhibition 2