第三章 菌种选育、保藏.ppt.Convertor

1 第三章 发酵菌种及其选育 1 2 第一节 常用微生物及菌种保藏 2 3 立克次氏体 衣原体 放线菌 蓝细菌 细 菌 葡萄球菌 原核生物类 支原体 3 4 真核生物类 黑根霉 酵母菌 猴头菇 灵芝 4 5 丝状真菌形态 5 6 1 细菌 放线菌 一 常用微生物 6 7 2 真菌 酵母菌 啤酒酵母等 霉菌 菇类 食用菌 药食两用 毛霉属 根霉属 曲霉属 青霉属等 生产菌种有何特性 人们对其有何要求 7 8 1 在遗传上必须是稳定的 2 易于产生许多营养细胞 孢子或其他繁殖体 3 必须是纯种 不应带其他杂菌及噬菌体 4 种子的生长必须旺盛 迅速 5 产生所需要的产物时间短 6 产物比较容易分离提纯 7 抵抗杂菌污染能力及其他抗性较强 8 菌株对诱变剂处理较敏感而可能选育出高产菌株 9 在规定的时间内 菌株必须产主预期数量的目的产物 并保持相对的稳定 二 生产对菌种的要求 8 9 1 菌种的退化 菌种在培养或保藏过程中 由于自发突变的存在 出现某些原有优良生产 性状的劣化 遗传标记的丢失等现象 称为菌种的退化 衰退 衰退的常见表现 菌落和细胞形态的改变 生长速度缓慢 产孢子越来越少 抵抗力 抗不良环境能力减弱等 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降等 三 菌种的衰退 复壮及保藏 9 衰退与复壮的概念 衰退 degeneration 在微生物的生长过程中 由于变异的存在 使原有的 优良性状发生负变 即菌种的衰退 衰退的原因 有关基因负突变 1 多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏 细菌 1 个月 酵母菌 3 个月 放线菌 霉菌 芽孢 半年 2 培养条件 3 诱变时出现不纯菌落 10 认识衰退的原因 内在原因 外在原因 内在原因 基因突变 质粒脱落 基因自发负向突变 基因回复突变 10 衰退与复壮的概念 衰退 degeneration 在微生物的生长过程中 由于变异的存在 使原有的 优良性状发生负变 即菌种的衰退 衰退的原因 有关基因负突变 1 多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏 细菌 1 个月 酵母菌 3 个月 放线菌 霉菌 芽孢 半年 2 培养条件 3 诱变时出现不纯菌落 11 认识衰退的原因 内在原因 外在原因 外在原因 连续传代 培养条件 保藏条件 涉及概念 基因型 表型 11 衰退与复壮的概念 衰退 degeneration 在微生物的生长过程中 由于变异的存在 使原有的 优良性状发生负变 即菌种的衰退 衰退的原因 有关基因负突变 1 多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏 细菌 1 个月 酵母菌 3 个月 放线菌 霉菌 芽孢 半年 2 培养条件 3 诱变时出现不纯菌落 12 防止菌种衰退的方法 控制传代次数 一般在 DNA 的复制过程中 碱基的错配率是 5x10 4 自发突变的 频率为 10 8 10 9 采用良好的菌种保藏方法 可以减少移种和传代的数 选择合适的培养条件 采用不同类型的细胞进行传代 对丝状微生物而言 通常采用稳定的单核孢子进 行接种 采用有效的菌种保藏方法 12 芩沛森 177 13 2 菌种的复壮 指使衰退的菌种恢复原来优良性状 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下 通过纯种分离和生产性能测定等方 法 从衰退的群体中找出未衰退的个体 以达到恢复该菌原有典型性状的措施 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识地 经常地进行纯种的分离 和生产性能测定工作 以期菌种的生产性能逐步提高 实际上是利用自发突变 正变 不断地从生产中选种 也称为生产选育 13 14 菌种的复壮措施 纯种分离 平板划线法 涂布法 倾注法 单细胞挑取法等 通过寄主体内生长进行复壮 淘汰已衰退的个体 采用比较激烈的理化条件进行处理 以杀死生命力较差的已衰 退的个体 纯 的程度不同 分为 菌落纯 菌株纯 14 15 3 菌种保藏 目的 存活 不丢失 不污染 防止优良性状丧失 随时为生产 科研提供优良菌种 原理 选用优良的纯种 最好是休眠体 如分生孢子 芽孢等 创造降低微生物代 谢活动强度 生长繁殖受抑制 难以发生突变的环境条件 如干燥 低温 缺氧 缺 营养 以及添加保护剂等 15 16 菌 连续在培养基上 内 移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上 内 移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质 蒸馏水 糖液 其它溶液 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上 菌种的保藏方法 16 17 低温保藏法 方法 菌种管置 4 冰箱保藏 定时传代 原理 低温下 微生物代谢强度明显下降 石蜡油低温保藏法 橡皮塞取代棉塞 加石蜡油 干燥保藏法 将菌种置于土壤 细纱 滤纸 硅胶等干燥材料上保藏 如砂土管法 适用于 放线菌 芽孢菌和某些真菌保藏 保藏时间几至几十年 17 1 暂时保藏法 斜面保藏 方法 斜面置 4 冰箱保藏 定时传代 原理 低温下 微生物代谢强度明显下降 优点 适用于各种微生物 简便易行 易 于观察 缺点 保藏时间短 传代频 易退化 易 污染 工作量大 改良方法 橡皮塞取代棉塞 加矿油 2 长期保藏法 原理 运用干燥 低温和隔绝空气等手段 降低 微生物菌种的新陈代谢速率 使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态 以达到 长期保存的目的 方法 砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法 1 砂土管法 干法 适用于部分真菌 放线菌 将斜面上 孢子刮下 接种于无菌砂土管中 砂 装试管 2 5 搅拌均匀 湿法 斜面中加 3 5ml 无菌水制成菌悬液 取菌 悬液 10 滴加入砂土管 以管内砂全部湿 润为宜 将砂土管置于干燥器中真空干燥 低温或室温下保藏 适用于放线菌 芽孢菌和某些真菌保藏 保藏时间几至几十年 2 真空冷冻干燥法 3 液氮超低温保藏法 18 真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥 适用于各种微生物 便于大 量保藏 菌种存活时间长 是目前最好的保藏方法 液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中 预冻后保存在液氮超低温冰箱中 196 适用于各 种微生物的较理想的保藏方法 18 真空冷冻干燥法 在干燥的条件下又保持真空来保藏菌种 原理 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥 使微生物细胞处于半永久的休眠状态 以达到长 久保藏的目的 方法 用无菌脱脂牛奶作保护剂 加入 3ml 于斜面中制成 菌悬液 分装在安瓿中速冻真空干燥 真空度维持在 0 1 0 3mmHg 悬液维持冻结状 水分不断升华 至菌体混合物呈疏松状 熔封 优点 适用于各种微生物 便于大量保藏 可避免污染 菌种存活时间长 几到几十年 缺点 手续繁琐 液氮超低温保藏法 方法 用 10 甘油 二甲亚砜或蔗糖和吐温 80 作保护剂 将菌种分散于其中 或将长 菌的琼脂块放入保护剂中 熔封后迅速 降温至 35 预冻后保存在液氮超低温 冰箱中 196 优点 适用于各种微生物的较理想的保藏方法 缺点 需专门设备 使用时速融 30 40 水浴摇动 融后 以无菌手续开启 19 几种常用菌种保藏方法的比较 方法名称方法名称方法名称方法名称主要措施主要措施主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期保藏期保藏期评价评价评价评价 冰箱保藏法 斜面 冰箱保藏法 斜面 冰箱保藏法 斜面 冰箱保藏法 斜面 冰箱保藏法 半固体 冰箱保藏法 半固体 冰箱保藏法 半固体 冰箱保藏法 半固体 石蜡油封藏法石蜡油封藏法石蜡油封藏法石蜡油封藏法 沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法 冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法 低温低温低温低温 低温低温低温低温 低温 缺氧低温 缺氧低温 缺氧低温 缺氧 干燥 无营养干燥 无营养干燥 无营养干燥 无营养 干燥 无氧 低干燥 无氧 低干燥 无氧 低干燥 无氧 低 温 有保护剂温 有保护剂温 有保护剂温 有保护剂 各大类各大类各大类各大类 细菌 酵母菌细菌 酵母菌细菌 酵母菌细菌 酵母菌 各大类各大类各大类各大类 产孢子微生物产孢子微生物产孢子微生物产孢子微生物 各大类各大类各大类各大类 3 63 63 6 月月月月 6 126 126 12 月月月月 1 21 21 2 年年年年 1 101 101 10 年年年年 5 155 155 15 年年年年 以上以上以上以上 简便简便简便简便 简便简便简便简便 简便简便简便简便 简便简便简便简便 有效有效有效有效 简便简便简便简便 有效有效有效有效 19 20 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种 菌株 并加以妥善保管 使之 达到不死 不衰 不乱以及便于研究 交换和使用的目的 菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会 CCCCM 美国的典型菌种保藏中心 ATCC 英国国家典型菌种保藏所 NCTC 法国里昂巴斯德研究所 IPL 国内外菌种保藏机构 20 21 方法 1 自然选育 2 诱变育种 1927 年 发现了 X 射线诱发突变 3 杂交育种 4 代谢控制育种 5 基因工程育种 第二节 工业微生物菌种选育 微生物菌种选育的基础 遗传和变异 21 22 自然选育是指在特定环境下长期处理某一微生物培养物 同时不断地 移种传代 以达到积累和选择合适的自发突变 spontaneous mutation 体的育种方法 自发突变的频率较低 变异程度不大 所以 用该法培育新菌种的过 程十分缓慢 后来发展了诱变育种 杂交育种 尤其是基因工程等育种技术 一 自 然 选 育 自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗 BCG vaccine 法国 的卡尔密脱 Calmette 和介林 Guerin 把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁 甘油 马 铃薯培养基上 连续传代培养 230 代 前后经历 13 年时间 终于在 1923 年获得显著 减毒的结核杆菌 卡介苗 22 23 一 从自然界中分离菌株 菌株分离 seperation 就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离 技术区分开 并按照实际要求和菌株的特性采取迅速 准确 有效的方法对它们进行 分离 筛选 进而得到所需的微生物的过程 23 24 分离微生物新种的具体过程大体可分为采样 增殖 纯化和性能测定 典型的微生物新种分离筛选过程 24 25 二 从自发突变体中分离菌株 通常与菌种复壮一同进行 故也称为生产选育 要有这种意识 25 26 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株 往往低产甚至不产所需的产物 只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育 基因突变 体内重组 体外重组 基因工程 26 27 二 诱变 育 种 一 回顾有关知识 基因突变的特性 表型的改变 突变的分子机理 DNA 损失的修复 27 28 突变表型的种类 1 形态突变型 2 营养缺陷型 3 条件致死突变型 4 致死突变型 5 抗性突变型 基因突变的特性 1 非对应性 2 稀有性 3 独立性 4 可诱变性 5 可遗传性和恢复性 28 29 突变的分子机制 基因点突变 碱基置换 转换和颠换 移码突变 易位突变 染色体畸变 缺失和重复 倒位和易位 29 30 诱变剂及诱变机理 1 物理诱变剂 紫外线 X 射线 r 射线 快中子 微波 超声波 电磁波 激光射线 和宇宙线等 其中对微生物诱变效果较好 应用较广泛的是紫外线 X 射线 r 射 线和快中子 30 31 紫外线的诱变机制 有的是 DNA 与蛋白质的交联 有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作 用 有的是 DNA 链的断裂 还存的是形成嘧啶二聚体 形成嘧啶二聚体是产生突变的 主要原因 紫外线有效光谱 最有效的波长为 253 7nm 而 15w 紫外灯管 放射出来的紫外线大约 有 80 波长集中在 253 7nm 31 32 2 化学诱变剂 碱基类似物 用于诱发突变的碱基类似物有 5 BU 5 FU 5 IU 等他们是胸腺嘧啶的 结构类似物 AP 6 MP 是腺嘌呤的给 结构类似物 最常用是 5 BU 和 AP 32 33 例举 5 溴尿嘧啶 5 BU 诱变 机理 与碱基的结构类似 在 DNA 复制时 它们可以被错误地掺入 DNA 引起诱变效应 酮式的 5 BU 结构与胸腺嘧啶相似 与 A 配对 5 BU 很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构 烯醇式 5 BU 不与 A 而与 G 配对 A T G C 33 34 嘧啶的紫外线光化产物 烷化剂及其作用机制 烷化剂主要是通过烷化基团使 DNA 分子上的碱基及磷酸部分烷化 DNA 复制时导致碱基配对错误而引起突变 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价 键断裂 而造成突变 常用的有 亚硝基胍 NTG 有超诱变剂之称 黄色晶体物质 性质不稳定 容易光解 有剧毒 甲基磺酸乙酯 EMS 硫酸二乙酯 DES 等等 34 35 脱氨剂 亚硝酸是一种常用的诱变剂 其诱变机制是脱去碱基中的氨基变成酮 基 引起碱基转换而发生变异 A H C U G X A T G C 和 G C A T 亚硝酸除了脱氨基作用外 还可引起 DNA 交联作用 DNA 复制 从而 导致变异 35 36 移码诱变剂 移码诱变剂与 DNA 相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变 它 们主要包括吖啶黄 吖啶橙 ICR 171 ICR 191 等 移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用 诱发细菌 放线菌的质粒脱 落比其他诱变剂效果更为显著 如某些产生抗生素的放线菌 用其处理后 发现产量 明显下降 主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的 36 37 其他化学诱变剂 秋水仙碱 主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成 导致多倍体的产 生 抗生素 作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素 丝裂霉素 放线菌素 光辉霉素 和阿霉素等 一般不单独使用 常与其他诱变剂一起复合使用 特别注意化学诱变剂的操作安全 化学诱变剂多数是极毒的致癌药品 在进行诱变操作后的处置以及诱变剂 的保藏等方面的安全防护都是极其重要的 如有疏忽 就可能对健康和环境带来恶果 万万不可麻痹 要严格按操作规程做 37 38 DNA 损伤的修复 光复活作用 微生物等生物的细胞内存在光复活酶 光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体 并与之结合形成复合物 打开二聚体 将 DNA 复原 可见光光能 300 500nm 激活光复活酶 此时光复活酶没有活性 38 39 PRE 为光复活酶 39 40 暗修复 细胞内还存在另一种修复体系 它不需要光激活 可修复由紫外线 射线和烷化剂等对 DNA 造成的损伤 暗修复体系有四种酶参与反应 40 41 核酸内切酶切开二聚体的 5 末端 形成 3 OH 和 5 P 的单链缺口 核酸外切酶从 5 P 到 3 OH 方向切除二聚体 并扩大缺口 DNA 聚合酶以另一条互补链为模板 从原有链上暴露的 3 OH 端起合成缺失片 段 连接酶将新合成链的 3 OH 与原链的 5 P 相连接 41 42 诱变育种是以人工诱变手段诱发微生物基因突变 改变遗传结构和 功能 通过筛选 从多种多样的变异体中筛选出产量高 性状优良的突变株 并且找 出发挥这个突变株优良性状的最佳培养基和培养条件 使其在最适的环境条件下合成 有效产物 二 诱变育种的基本程序 42 43 二 诱变育种的基本程序 诱变育种过程分为三个阶段 1 种基因型的改变 诱变 2 筛选菌种 确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株 3 产量评估 全面考察此变异株在工业化生产上的接受性 性能测定 43 44 变异的实质 对微生物本身来说 是使其代谢向着异常方向发展 必然引起菌体 基本代谢失调 此时菌体虽然具有生活能力 但细胞的某些功能却显著地降低了 如 孢子数量由多变少 生活周期延长 偶然也使某些目的产物的产量提高 这都表现了 高产菌株的特征 44 45 高产突变型 是一种数量性状的遗传变异 是由多基因决定的 如结构基因 调节基因 渗透基因 辅助基因等 这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变 只 能逐步累加 即进行连续多代的诱变育种 才能使产量提高到生产所需的水平 例 一株荨麻青霉 灰黄霉素产生菌 经连续 13 代诱变育种 发酵单位比野生 型菌株提高 100 多倍 45 46 诱变育种的准备工作 A 诱变前对出发菌株的了解 区分不同菌落类型 一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会出现多种形 态类型的菌落 约有 2 5 种 不同类型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异 出现不同菌落的原因 遗传因素决定 环境因素 如培养基或培养条件等的改变 引起菌落形态的变化 区分和认识不同菌落类型的生物学特征及其生产能力 对生产用菌和 提供改良的出发菌株非常重要 46 47 B 了解菌种特性及其与生产性能的关系 考查菌种的生活史 了解其形态 生理 生化等特性 以及这些特性与代谢产物 合成的关系 菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性 C 了解影响菌种生长发育的主要因素 培养基及其制备技术 移种的密度 温度 湿度 pH 等 药品和原材料质量 47 48 D 了解菌种有效产物中 各种组分在代谢合成 过程中与培养条件的关系 例 由棘孢小单孢菌产生的庆大霉素 其中 C1 是有效成分 C2 是无效的 当发 酵到 130 135h C1 组分最高 E 建立一个准确 简便 快速检测产物的方法 F 研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件 48 49 诱变育种的基本程序 主要包括 出发菌株的选择 单孢子 或单细胞 菌悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择 诱变的处理方法 菌种的纯化分离与筛选 49 50 1 出发菌株的选择 50 51 出发菌株的选择及其特点 1 从自然界样品中分离的野生菌株 产量较低 但对诱变敏感 变异幅度大 正突变率高 2 在生产中使用的 具有一定生产能力 并在生产过程中经过自然选育的菌株 3 选择具有有利性状的菌株 如生长速度快 营养要求低 产孢子早而多 不 产或少产色素 生活能力强 周期短以及糖氮利用快 耐消泡 黏度小等性状的菌株 作为出发菌株 51 52 4 采用一类被称为 增变菌株 的变异菌株 它们对诱变剂的敏感性比原始菌 株大为提高 宜作为出发菌株 5 在选择产核苷酸或氢基酸的出发菌株时 应考虑至少能积累少量所需产物或 其前体的菌袜 而在选择产抗生素的出发菌株时 最好选择已通过几次诱变并发现每 次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株 52 53 选择出发菌株的其他因素 选择纯种作出发菌株 诱变中要选用单倍体 单核或少核的细胞为出发菌株 还应考虑其稳 定性 采用多出发菌株 一般采用 3 4 个出发菌株 当一个菌株经长期诱变后 产量仍然得不到明显的提高时 应考虑更换 或重新筛选野生型菌株 或许会收到更大效果 53 54 2 制备菌悬液 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态 悬液的均一性和环境条件 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触 避免出现不 纯的菌落而给后续的筛选工作造成困难 用玻璃珠振荡打散细胞团 再用脱脂棉花或滤纸过滤 得到分散的菌体 产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢 54 55 对菌丝体进行诱变处理 有些丝状菌在一般培养条件下不产孢子 育种时只能以多核菌丝体及碎 片作为材料 用这些材料进行诱变往往因遗传分离而产生不纯或不稳定现象 一般处 理方法有三种 菌丝尖端法 处理单菌落周围尖端菌丝 混合处理法 55 56 制备原主质体作为诱变材料 微生物细胞具有细胞壁 其中的一些成分如黑色素会吸收紫外线 丫射线和 X 射线的能量 降低诱变效果 原生质体没有细胞壁 外界的理化因子可以 直接进入细胞 使细胞核内 DNA 碱基结构发生变化 可增强诱变效果 56 57 1 诱变剂种类的选择 实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的 不同微生物对 同一种诱变剂的敏感性有很大区别 根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂 对遗传稳定的出发菌株 最好采用以前没有使用过的 突变谱较宽 诱变率高的强诱变剂进行复合处理 使 DNA 结构发生严重损伤 3 诱变处理 57 58 参看出发菌株原有的诱变谱系选择诱变剂 通常做法是 取几种诱变剂 各取不同剂量做一系列诱变试验 挑选 处理后的菌落上千个 进行生产能力的测定 然后分别统计它们正突变株 负突变株 和稳定株的频率 要注意选择专一性比较强的诱变剂 诱变剂主要对 DNA 分子上基因的某一位点发生作用 应根据诱变剂的 作用机制 再结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂进行诱变 58 59 剂量的大小常以致死率和变异率来确定 因此在诱变处理前 应预 先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线 选择合适的处理剂量 2 合适诱变剂量的选择 就一般微生物而言 突变率随剂量的增大而增高 但达到一定剂量后 再加 大剂量反而会使突变率下降 致死率在 60 80 较适宜 不同微生物或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂的最适剂量是有 区别的 在实际育种工作中 具体到某个菌种对某种诱变剂量适剂量的确定 做突变 剂量曲线是比较可靠的 59 60 3 诱变剂的处理方式 可分为单因子处理和复合因子处理 单因子处理 是采用单一诱变剂处理 一般认为单因子不如复合因子处理效果好 但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变因子 那么单因于处 理同样能够引起基因突变 效果也不错的 单一诱变剂处理 还可以减少菌种遗传背 景复杂化 菌落类型分化过多的弊病 使筛选工作趋向简单化 60 61 复合因子处理 是指两种以上诱变因子共同 诱发菌体突变 1 两种以上因子同时处理 即不同的诱变剂同时处理菌体 诱发突变 2 不同诱变剂交替处理 通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好 61 62 4 紫外线 光复活交替处理 经紫外线照射后的菌体或菌悬液 暴露在日光中一定时间 接着用剂量 更大的紫外线继续照射 然后再让其光照复活 经多次紫外线照射和光照复活交替 可以增加变异率 提高变异幅度 3 同一种诱变剂连续重复使用 经过一种诱变剂处理后的菌悬液 培养数小时之后 细菌或酵母 使细胞分裂 1 2 代 接着再处理 有时还可反复多次 诱发能力强的 对基因作用较 为广谱的诱变剂可连续重复使用 有益于变异率的提高 但是单因子连续使用代数不 能过多 否则也会出现 钝化 现象 62 63 复合因子处理中 为了提高诱变效果 在具体使用时 要注意诱变剂的 协同效应 先用弱诱变因子 后用强诱变因子处理往往具有协同效应 5 诱变剂处理时间与诱变效应的关系 在头孢菌素 C 产生菌选育中用甲基磺酸乙酯低浓度 长时间处理与高 浓度 短时间处理的诱变效应是不同的 在致死率大致相同的情况下 前者比后者不 仅正突变率高 而且提高的幅度也大 63 64 实 例 64 65 诱变后的情况 4 突变菌株的分离与筛选 65 66 常规分离程序 66 67 菌种筛选的策略 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求 初筛 要力求快速 简便 复筛 应该做到精确 测得的数据要能够反映将来的生产水平 从菌体形态变异分析 初筛 有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性 在筛选工作中应尽可 能捕捉 利用这些直接的形态特征性变化 67 68 平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应 将肉眼 观察不到的产量性状转化成可见的 形态 变化 纸片培养显色法 变色圈法 透明圈法 生长圈法和抑制圈法等 定性或半定 量用 大大提高筛选的效率 初筛 68 69 69 70 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中 振荡培养 然后 再对培养液进行分析测定 特殊变异菌的筛选方法 营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 抗生素抗性突变株 条件抗性突变 70 71 营养缺陷型突变株 浓缩 进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤 筛选步骤 浓缩营养缺陷型菌株 常用的浓缩方法有抗生素法 菌丝过滤法 差别杀菌法和饥饿法等 目的 淘汰大量野生型 使营养缺陷型占的比例增加 71 72 进一步检出所需缺陷型 逐个检出法 影印培养法 72 73 一般从菌落大小也可以判断 新长出的菌落较小 即是营养缺陷型 夹层培养法 营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物 生长谱法 组合补充培养基法 73 74 抗阻遏和抗反馈突变型 抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的 在细胞中已经有大量最终代 谢产物时仍然继续不断地合成这一产物 选育结构类似物抗性突变株 结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸 嘌呤 维生素等代谢产物结构相类似的 物质 主要用于末端产物的积累 74 75 文献实例 75 76 76 77 77 78 78 79 抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中 通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外 还能提高其它代谢产物的量 条件抗性突变 因环境不同 能表现为 野生型 菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗 性突变或称为条件致死突变 温度敏感突变常用于提高代谢产物产量 79 80 抗性突变菌株的筛选方法 阶梯性筛选法 80 81 利用原核生物的接合 转化 转导和真核生物的杂交以及原生质体融合等遗传 学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组 以改良菌种的育种方法 一 原生质体融合 将遗传性状不同的两种菌 包括种间 种内及属间 融合为一个新细胞的技术 三 体内基因重组育种 81 82 第一 大幅度提高亲本之间重组频率 第二 扩大重组的亲本范围 第三 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换 遗传物质转移和重组性状较多 集中双亲本优良性状机会更大 不足之处是 原生质体融合后 DNA 交换和重组随机发生 增加重组体分离筛选的 难度 与常规杂交相比 原生质体融合具有多方面的优势 82 83 微生物原生质体融合的一般原理和过程 步骤包括 选择亲株 原生质体的制备 原生质体的融合 原生质体再生和融合子 选择等 83 84 1 选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 为了能明确检测到融合子 参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传 标记 如营养缺陷型或抗药性等 2 原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键 84 85 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成 溶菌酶 微球菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆菌 黄色八叠球菌 革兰氏阴性菌不能直接溶壁 只有当乙二胺四乙酸 EDTA 存在时 某些革 兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解 金黄色葡萄球菌 溶菌酶不能溶解 表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶 葡萄球菌素 溶解 85 86 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶 真菌细胞壁主要由纤维素 几丁质和葡聚糖等组成 青霉菌多用纤维素酶和 1 3 糖苷酶等溶壁 曲霉用 1 3 糖苷酶和 1 4 糖苷酶等 酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质 蜗牛酶 86 87 87 88 培养基中添加甘氨酸 可以使菌体较容易被酶解 在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性 在菌体生长对数期加入适量青霉素 就能使细胞对溶菌酶更敏感 菌龄 对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低 对溶菌酶敏感 影响原生质体制备的其他因素 一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性 88 89 原生质体的收集和纯化 1 过滤法 使用沙芯漏斗 2 密度梯度离心法 3 界面法 4 漂浮法 原生质体的保存 1 立即进行融合或其它方式育种 2 5 的二甲亚矾或甘油等其他保护剂 液氮低温保存 89 90 影响原生质体再生的因素 菌体生理状态 如菌龄 稳定剂 高渗环境 如糖 盐等 酶浓度和酶作用时间 适当的酶解条件 不同微生物的原生质体的最适再生条件不同 最重要的一个共同点是都需要高 渗透压 原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁 恢复完整的细胞形态结构 90 91 影响原生质体再生的因素 再生培养基组成 碳源影响原生质体复原率 丝状真菌 酵母等的原生质体 仅能在固体培养基上再生 再生培养基要用稳定剂配制 还含有 Ca2 和 Mg2 等等 残存菌体的分离 避免未酶解细胞的影响 原生质体密度 不能过密 再生方法 原生质体不能承受较强的机械作用 不能用玻璃棒涂布 一般采 用双层平板法 91 92 原生质体再生率 细菌为 3 10 真菌在 20 80 再生率计算 再生率 C B A B 100 A 总菌落数 即未经酶处理的菌悬液涂布于平板长出的菌落数 B 未形成原生质体细胞数 C 再生菌落数 即原生质体再生的菌数与未形成原生质体细胞形成的菌落数 92 93 3 原生质体融合 聚乙二醇 PEG 能有效地促进原生质体融合 采用电融合仪 在高频电场下 用直流电穿孔来进行融合 原生质体融合过程 107 108 ml 原生质体 加 25 50 PEG 及适量的 CaCl2 MgCl2 在一 定 pH 的稳定剂中 20 30 1 10min 之后稀释 离心分离 93 94 原生质体融合的影响因素 1 触合剂 不同种类微生物对 PFG 分于量的要求不尽相同 物理融合剂 电 场和激光是较常用的融合剂 2 温度和时间 丝状真菌适宜融合的温度约为 30 而细菌原生质体融合的适