神经系统遗传病的基因诊断

神经系统遗传病的基因诊断,杜万良北京天坛医院神经内科,基因,DNA上的功能单位。基因结构模式图：,基因突变,DNA分子结构的化学变化。,突变的类型,碱基替换：某个碱基被另一个碱基所取代（点突变）。嘌呤或嘧啶之间的取代为转换；嘌呤与嘧啶之间的取代为颠换。同义突变：突变后密码子改变但氨基酸不变化。错义突变：突变后氨基酸发生改变。无义突变：突变后变为终止密码。碱基插入和缺失：由于碱基的增多或减少造成阅读框架的改变移码突变。以上突变为稳定突变，即传递中不再变化的突变。动态突变：传递中不断发生变化的突变，如三联体核苷酸数目的变化，一般是由于不等交换所致。,突变的一般特性,可逆性 (Aa, aA)多向性(Aa1, a2, a3, a4)有害性稀有性(Human, 10-6)可重复性(Hot site),遗传病,由于遗传物质缺陷或发生改变而导致的机体结构和功能的紊乱。,遗传病的危害,1、发病率逐年上升2、住院儿童近1/3为遗传相关疾病3、自然流产胚胎60%有染色体畸变4、平均每人携带56个有害基因5、人群中25%患有各类不同程度的遗传相关疾病6、绝大多数遗传病目前没有理想的治疗方法,遗传病的分类,染色体病单基因病多基因病线粒体基因病,染色体病,染色体病:染色体数目或结构异常。常染色体病的共同特征：智力低下、发育迟缓、多发畸形。性染色体病的共同特征：性征发育不全或畸形、智力较低。,21-三体综合征,21-三体又称先天愚型，Down综合征。 1866年英国医生JLH Down首先描述，1959年法国Lejeune证实该病的病因是由于G组染色体多了一条，后确定为21号。发病率：1/6001/800。临床表现：、特殊面容眼距宽、鼻塌平、口半开、流口水、耳廓小、手足短。、发育不良、肌张力低、关节松弛、新生儿有第三囟门。、部分患者有特殊肤纹，如通贯手、atd角达64(正常人41)，、半数患者伴有先天性心脏病，白血病发病率高于正常20倍。男性基本无生育能力，女性少数可有生育能力。大部分寿命不长，少数可达50岁以上。,单基因病,单基因病：染色体上单一基因的一个或两个等位基因突变。严格按照孟德尔规律遗传临床上最多见。,多基因病,多基因病：一个或多个基因与一种或多种环境因素共同作用产生的疾病。没有严格的孟德尔传递规律。病种少，但患病者多。,线粒体遗传病,线粒体遗传病是由于mtDNA的突变所导致。有性生殖的方式决定了线粒体遗传属于母系遗传。（细胞质遗传） 1987年首次提出线粒体病概念，目前已经发现100多种疾病与线粒体DNA突变有关,线粒体遗传病,线粒体基因组编码：2个rRNA基因和22个tRNA基因13种多肽基因：核糖体蛋白基因rps4，rps13，rps14细胞色素C氧化酶复合体基因coxI，coxII，coxIIIATP酶复合体基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10NADH脱氢酶复合体I基因：ND-1，DN-5,遗传病,大多数遗传病为先天性疾病，但先天性疾病不一定是遗传病。大多数遗传病表现出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遗传病。,遗传病诊断,1、病史、症状、体征 病史采集、外貌特征、发育状况。2、系谱分析 单基因，多基因；显性，隐性；常染色体，性染色体。 表现度、外显率、隔代遗传。 遗传方式、发病风险。3、染色体检查标本外周血、绒毛、羊水、活检组织。分带G-, R-, C-, 荧光原为杂交(FISH)分析数目（单体、多体）、结构（易位、缺失、倒位)指征智力障碍、发育畸形、多发流产、不育等。 4、生化检查 主要用于分子病和先天性代谢缺陷。 5、基因诊断 直接诊断被检者的DNA或RNA。发展最快，前景最好。直接DNA检测缺失、突变、重排.。间接遗传标记检测多态性，连锁分析。 基因诊断技术：分子杂交、分子扩增、分子测序。,传统的诊断（举例）：,、问、望、听、触经验型诊断、化验/检验材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。、影像学X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、特殊检查染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。,在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。,这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测也就是说“发病”了才能诊断。,基因诊断,Gene Diagnosis：detection of genetic disorders by DNA analysis 直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检测，从而辅助临床进行的诊断。基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊断技术，它依托DNA重组技术，直接从基因型入手，诊断表现型即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断。（逆向诊断）基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状细胞贫血病的产前基因诊断。基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊断方法。,基因诊断的对象,1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证,神经系统遗传病,Wilsons disease (WD)Huntingtons disease (HD)CadasilMelas(DMD)CMTSCALeigh,基因变异的类型,1、点突变）单个碱基置换）单个碱基的缺失或插入2、片段缺失编码片段；调节序列3、片段插入编码片段；调节序列4、重排融合基因5、扩增拷贝大量增加6、动态突变遗传物质传递过程中不等交换使STR重复数增加,原理：找突变,基础：PCR（聚合酶链反应）,DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性(92-95C,2-5m),变性(92-95C,30s),复性(40-60C,30s),延伸(72C,30-60s),总延伸(72C,7m),(25-35),PCR的一般过程：,经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。,策略1,直接诊断：直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病； 间接诊断：当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。,遗传标记,1、第一代遗传标记限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),8kb,5kb,3kb,在个体和群体中，片段长度表现出多态性。如3kb, 5kb, 7kb, 8kbRFLP呈现孟德尔式遗传。常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。,产生多态性的原因是内切酶位点的变化。原位点的消失；新位点的产生。,GAATTCCTTAAG,GATTTCCTAAAG,2kb,3kb,5kb,7kb,2、第二代遗传标记微卫星DNA(Micro-satellite DNA) 属高度重复序列，重复单元26bp，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,常用检查方法：PCR等。,微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：,500bp400bp300bp240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。,2、第三代遗传标记单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如：,个体A个体B个体C,SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP,芯片杂交结果示意图,A C G T,位点1位点2位点3,常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。,常用技术,等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO ）,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来. PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,异常探针 T A G,正常人 患者 DNA DNA,点杂交,正常探针 G A G,正常人 患者 DNA DNA,点杂交,单链构象多态性PCR (SSCP-PCR),DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。,对照 实验,等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR),利用末端突变的引物进行PCR。实际应用中，常使用三个引物：,A3,5,G3,5,5,3,正常上游引物,正常下游引物,突变上游引物,使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。（严格条件下的PCR）,ATGGTACCGCAT,染色体FISH探针,整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针,基本过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂交4、显微观察（染色体分带）,整条染色体涂染,通过整条染色体涂染判断易位染色体,引物原位标记技术(Primed in situ Labeling, PRINS),针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。 利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合, 然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中, 最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。,举例1,DMDBMD的缺失型诊断：DMDBMD是一种连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。DMDBMD有70左右为缺失型。此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。,举例2,脊肌萎缩症（SMA）5q13.1 SMN1,SMN2,举例3,Huntingtons Disease (HD)IT15 （CAG）n,举例4,腓骨肌萎缩症（CMT）Hereditary motor and sensory neuropathiesa clinically and genetically heterogeneous group of inherited neuropathiesdemyelination (CMT1) axonal loss (CMT2)autosomal-dominant, autosomal-recessive, and X-linked inheritance .,myelin protein zero (MPZ),early growth response gene 2 (EGR2)peripheral myelin protein 22 (PMP22)myotubularin related protein 2 gene (MTMR2)the N-myc downstreamregulated gene 1 (NDRG1)the L-periaxin gene (PRX)the ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 gene (GDAP1)connexin 32 gene (GJB1),GJB1 alteration (323TC),GJB1 mutation 323TC,举例5,CADASIL： subcortical ischemic stroke and vascular dementia in human adults.Notch3 is a large gene composed of 33 exons encoding for a 2321 amino-acids protein.mutations are highly stereotyped missense mutations,located within the 23 exons encoding for the 34 Epidermal Growth Factor (EGF)-like repeats of the extracellular domain of the Notch3 receptor, all mutations resulting either in a gain or a loss of a cysteine residue.High G-C Content up to 88% (mean G-C content 66%).In 65% of the patients, these mutations are clustered within exons 3 and 4 but in the 35% remaining ones, mutations are scattered through the 21 other exons.,举例6,MERRF综合症肌阵挛性癫痫和破碎红纤维病多系统紊乱，肌阵挛性癫痫，共济失调，轻度痴呆，耳聋，脊髓退化。大量团块状线粒体聚集于肌细胞中（可被特异性染料染成红色，破碎红纤维）。大脑卵圆核与齿状核有神经元的缺失。当线粒体中90%存在这种突变，将出现典型症状，当突变比例下降时，症状也随之变轻。,问题,各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常 。根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法 如基因缺失可用基因探针杂交，PCR扩增直接检测；点突变可用等位基因特异的ASO探针、SSCP等直接检查。一般无需对家系成员进行分析。但条件是必需知道基因异常的性质，并肯定该异常与疾病之间的关系。然而，由于许多疾病的遗传异质性，以及多数遗传的基因异常尚属未知，目前能直接诊断的病种虽日益增多，但仍然是比较有限的。,策略2,热点突变全基因扫描,肝豆状核变性,1. AR 2. 临床症状： 进行性肝硬化，伴有基底神经节豆状核变性，引起神经症状。 3. 病因：存在细胞膜上的与铜转运有关的ATP7B缺陷导致铜不能从细胞内及时清除而在组织中沉积。 4、基因定位：13q14.3,ATP7B gene maps to chromosome 13q14.3, contains 21 exons, and encodes a copper-transporting P-type ATPase. ATP7B mutations are scattered over the entire gene,Wilsons Disease (WD),Rapid identification of Wilsons disease carriers by denatu