荧光二聚体荧光探针测定蛋白质和DNA的研究进展张萍2012021000

染料二聚体荧光探针测定蛋白质和DNA 的研究进展 张萍 安徽师范大学化学与材料科学学院 摘要摘要 蛋白质和DNA在生命活动中起到重要的作用 蛋白质和DNA 的定量分析是食品科 学和分析化学中经常涉及的检测内容 建立高灵敏度 低检测限的荧光探针定量测定方法 对于准确分析食物的营养成分等具有重要意义 概括多种染料二聚体作为荧光探针测定蛋 白质和DNA 的研究进展 介绍了染料二聚体的结构特性和荧光性质 作用机制以及测定 时pH 温度和反应时间等因素的影响 并展望了染料二聚体的发展趋势和应用前景 关键词关键词 染料 二聚体 荧光法 蛋白质 DNA Research progress on determination of protein and DNA by dye dimer as fluorescence probe ZHANG Ping College of Chemistry Materials Science Anhui Normal University Abstract Proteins and DNA play an important role in the life activities The quantitative analysis of protein and DNA is a common analysis content in food science and analytical chemistry So it is very important to find a fluorescence probe with high sensitivity and low detection limit for the analysis of the nutritional content of food I summarized the research progress of dye dimer as fluorescence probe to determine protein and DNA The structure characters the fluorescence properties and the functional mechanism of dye dimer and the influencing factors such as pH temperature and time which affect the determination are presented I also discussed the prospect of the progress and application of dye dimer Key words dye dimer fluorescence method protein DNA 蛋白质和DNA作为生命的重要物质 因此对其的定量测定在食品科学 分析化学等相 关学科的发展起到十分重要的作用 荧光分析方法具有灵敏度高 测定精确 重现性好等 优点 因此 发现新型合适的荧光探针 在研究蛋白质和DNA的性质过程中就显得非常重 要 把荧光染料化合物用于分子探针 可以对体系微环境变化等做出响应 被广泛应用到 对蛋白质和核酸的定量测定和构象分析方面 近二十年来 新型的二聚体荧光染料探针引 起了人们极大的兴趣 在有机分子中 尤其是荧光染料在浓度大的水溶液或者极性大的有 机溶液中形成二聚体 引起明显的荧光猝灭 二聚体的形成目前主要有两种方式 人工合 成和现场形成 蛋白质和核酸都是生物大分子 因此以染料二聚体作为测定的荧光探针 在定量检测中具有重要的理论和实践意义 本文综述了多种以染料二聚体作为定量检测蛋 白质和核酸荧光探针的研究进展 综合分析了二聚体的结构特征和荧光性质 作用机制以 及测定是pH 温度和反应时间等因素的影响 并展望了染料二聚体的应用前景和发展趋势 1 染料二聚体荧光探针检测染料二聚体荧光探针检测DNA 1 1 吖啶类 吖啶的基本结构为二苯吡啶 在水溶液中呈弱碱性 1940 年 发现当吖啶橙与酸性物 质连接或存在酸性物质时 其特征光谱会发生一定的变化 一直被用于生物体的染色 吖 啶橙 Acridine Orange AO 是一种三环芳香类阳离子型的碱性荧光染料 常用于蛋白质和 DNA 的定量测定及活细胞的染色及其他荧光分析 在液相中 吖啶橙存在单体与二聚体 的平衡转化 其二聚体是不发荧光的 吖啶橙在十二烷基苯磺酸钠介质中存在形态之间的 平衡 DNA 的加入可使吖啶橙的平衡发生移动 导致体系荧光增强 其荧光强度与DNA 的浓度在一定的范围内呈线性关系 从而建立了测定DNA 的新的灵敏方法 该方法成功 应用于人体尿液中DNA 的临床测定 1 2 菁类 随着生物技术和荧光标示技术的飞速发展 菁染料已成为在DNA 蛋白质及核酸等分 析检测中使用的主要荧光探针 1 2 1 TOTO 类 1992 年 Rye 等合成了TO YO 的同型二聚染料 它们分别由单体噻唑橙TO和唑黄 YO通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二聚体 由于它们的分子中带有两个正电荷 所以与 带负电荷的ds DNA有着高度的亲和性 Pmdhemme 等在对dye ds DNA 复合物进行的结构 研究中 发现这类染料的两个喹啉发色团牢牢的嵌入于ds DNA 的双螺旋结构中 因此形 成的复合物比单体染料的复合物要稳定的多 Jason 等用溶液粘度测定法和原子力显微镜 解释了TOTO 与DNA 的双嵌入作用 Claire等发现 在DNA 存在时YO和YOYO会产生光 漂白 其原因主要在于氧化的碱基8 氧代 7 8 二羟基脱氧鸟嘌呤能使嵌入的YOYO 荧光 猝灭 1 2 2 花菁类 自1992 年Rye 等突破性地合成了性能独特的噻吩橙同型花菁双嵌入剂以来 荧光花 菁探针发展迅速 Yang 等将羧基引入近红外花菁染料 毛细管电泳激光诱导荧光检测 可以处理并检测0 8amol的染料 Shealy 等使用两种近红外菁染料对核酸M13 29 进行测序 发现菁染料 核酸结合体在测序过程中很稳定 得到的图谱易于解析 1 3 荧光素类 荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料 属于呫吨染料 荧光素的量子产率高 最 大吸收发射在492 525 nm 由于量子产率高 大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测 试剂 将荧光素共价连接到药物 蛋白质及其他生物活性分子上来合成探针 可用于蛋白 质 核酸 酶的检测及药物筛选等研究领域 林旭聪等应用钙黄绿素 臧红T 能量转移体 系为荧光探针 建立了DNA 的测定方法 李建晴等对四溴荧光素 TBF 四氯四溴荧光素 TTF 两种卤代荧光素与DNA 作用的荧光特性进行了研究 荧光猝灭实验和偏振实验表明 TBF与DNA的作用方式可能是沟槽键合和嵌插作用 而TTF嵌插在DNA碱基对之间 荧光 法测得TBF和TTF与DNA 的结合常数为1 106 和2 106 L mol 结合位点数为0 62 和 0 16 1 4 罗丹明类 罗丹明类染料属于碱性呫吨类染料 其水溶液有较大的摩尔吸光系数 由于分子结构 的刚性平面比较大 其单体水溶液能发生很强的荧光 罗丹明类染料在光度分析中有着广 泛的应用 常见的有罗丹明B 罗丹明6G 罗丹明101 德克萨斯红等 方光荣等 研究了 丁基罗丹明B BRB 与DNA作用的共振光散射光谱 其发光强度与DNA的浓度成线性关系 线性范围为5 8 2688 ng mL 检出限为5 8 ng mL 建立了用共振光散射谱RLS 测定纳 克级DNA 的新方法 张霞等利用荧光分光光度法研究了罗丹明B RB 与小牛胸腺 DNA CTDNA 的相互作用 结果表明DNA 的存在使得RB的荧光强度显著降低 RB以沟 槽模式与DNA相互作用 1 5 噻嗪和嗪类染料 这类染料分子结构简单 合成方便 但荧光量子产率较低 限制了其应用 主要有耐 尔蓝 耐尔红和嗪750等 基于DNA 或RNA 对耐尔蓝荧光的猝灭效应 陈秋影等对耐尔 蓝荧光探针法测定核酸进行了研究 建立了一种新的DNA 或RNA 的测定方法 JA242 嗪 染料与发夹结构寡核苷酸端基连接形成灵敏探针 Smart probe 杂交前被茎杆结构处的鸟 嘌呤残基所高度猝灭 1 6 吩噻嗪类 吩噻嗪类化合物包括亚甲蓝 MB 甲苯胺蓝 TB 和硫堇等 其分子结构为芳香性 的三元平面稠环 可以以嵌插方式作用于DNA 分子碱基对 还可以通过自身所带的电荷 与DNA 发生静电吸附作用 叶芳贵等观察到甲苯胺蓝与DNA 相互作用时 荧光被猝灭 基于此原理 建立了高灵敏荧光分光光度法测定DNA 的新方法 李原芳等研究发现硫堇 与DNA 相互作用时 DNA 使硫堇的光散射增强 荧光发生猝灭 而且光散射增强与荧光 猝灭之比与DNA 浓度在一定范围内呈线性关系 从而建立了测定DNA 的光散射 荧光比 率法 2 染料二聚体与蛋白质的作用机理染料二聚体与蛋白质的作用机理 染料二聚体在水溶液中以单体和二聚体形式存在 加入离子表面活性剂后 二者先是 以静电力作用形成离子缔合物 随着表面活性剂浓度的增大 表面活性剂分子自相接触 憎水基靠拢形成胶束前的预聚集 水分子在表面活性剂分子或胶束预聚集分子周围形成有 序的区域 即所谓的 冰山结构 导致溶剂的性质向着有利于染料二聚体形成的方向变化 由于表面活性剂是一类蛋白质变性剂 可与蛋白质分子产生强烈作用 破坏蛋白质分子内 非共价作用力 所以将蛋白质加入到弱荧光的二聚体体系时 蛋白质分子同时与体系中的 染料 染料二聚体及表面活性剂发生结合作用 破坏了染料二聚体赖以形成的微环境条件 导致体系荧光强度的变化 从而可以用来测定蛋白 冯喜增等用光谱法研究了水溶液体系中吖啶橙与牛血清白蛋白分子问的相互结合反应 其结合常数为k 4 8 103 mol L 结合位点数为n 0 2 并证实了吖啶橙与牛血清白蛋白 的相互结合作用为单一的静态猝灭过程 且阐明了其猝灭机制是通过能量转移产生的 3 结语结语 蛋白质和DNA 都是重要的生物大分子 其定量分析是食品科学 临床检验及分析化 学等领域的重要课题 染料二聚体作为一类新的荧光探针引起了人们的极大关注 随着基 因组学和生命科学的研究深入 越来越多的有机小分子与蛋白质和DNA 之间的相互作用 被研究并应用于蛋白质和DNA 的分析检测 目前 人们对于生物大分子及其荧光探针的 研究 已取得一些成果 但也有要解决的问题 高灵敏的染料二聚体荧光探针的合成与应 用仍是今后研究的热点 在我国 开展蛋白质和DNA 高灵敏荧光探针的研究与应用 对 于提高食品分析技术水平 促进我国在现代分子生物学 现代医学 遗传工程等学科领域 的研究与应用 缩小和赶超在这些领域与国际先进水平的差距 具有非常紧迫和现实的意 义 参考文献参考文献 1 赵瑜 李隆弟 罗丹明和荧光素类染料的固体基质室温磷光研究 J 分析化学 1996 24 7 745 749 2 Chen GuoNan Wang Jian The enhanced electrogenerated chemiluminescence of Ru bpy by glutathione on aglassy carbon electrode modified with some porphine compounds J Airalyst 2000 125 2294 2299 3 Markovits J Rogues B P Ethidium dimer a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids J Analytical Biochemistry 1979 94 2 259 264 4 Bruns E B Murphy C J BergM A Local dynamics in DNA by temperature dependent stokes shifts of an intercalated dye J JAmChem Soc 1998 120 2449 2456 5 KononovA I MoroshkinaE B TkachenkoNV et al Photophysical processes in the complexes of DNA with ethidium bromide and acridine orange a femtosecond study J J Phys Chem B 2001 105 535 541 6 H S Rye Stable fluorescent complexes of double stranded DNA with bis intercalating asymmetric cyanine dyes properties and applications J Nucleic Acids Res 1992 20 11 2803 2812 7 S Pmdhemme eleL J Photochem M Photobiol B Bio1999 53 60 8 JABordelon KJFeierabend SASiddiquietal J Viscometry and Atomic Force Microscopy Studies of the Interactions of a Dimeric Cyanine Dye with DNAPhys J Chem B 2002 106 4838 4843 9 K Claire A Bjo1rn T Eimer J Photobleaching of Asymmetric Cyanines Used for Fluorescence Imaging of Single DNA Molecules J Am Chem Soc 2001 123 7985 7995 9 Yu T Ogulchansky Yu M et al Interactions of cyanine dyes with nucleic acids XXIV Aggregation of monomethine cyanine dyes in presence of DNA and its manifestation in absorption and fluorescence spectra J Spectrochimica Acta Part A 2001 57 1525 10 C M Yang O Shimelis X J Zhou et al Handling and detection of 0 8 amol of a near infrared cyanine dye by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection J Chromatography A 2002 979 307 314 11 D B Shealy Synthsis Chromatographic sepation and characterization of near infrared labeled DNA oligomers for use in DNA sequencinga J Anal Chem 1995 67 247 251 12 葛凤燕 闫喜龙 荧光素类探针在生物分析中的研究进展 J 分析化学 FENXIHUAXUE 评述与进展 2005 33 8 1124 1203 13 张华山 王红 赵媛媛 分子探针与检测试剂 M 北京 科学出版社 2002 170 171 14 林旭聪 郭良洽