蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)

1 2 1 蔗糖合成酶 SS 蔗糖磷酸合成酶 SPS 活性 参照於新建 的方法并稍加改进 酶液提取 取0 5g左右预冷的水稻叶片 剪碎的去主叶脉的叶片 加4 mL缓冲液 A 50mmol L Tris HC1 pH 7 0 10 mmol L MgC12 2 mmol L EDTA Na2 20 mmol L巯基乙醇 2 乙二醇 于预冷的研钵中冰浴快速研磨成糊状 倒入离心管中 在 低温冷冻离心机上4 10000 r rmin离心30 min 所得上清液用于酶活性测定 SS活性的测定活性的测定 在总体积0 15 mL的反应介质 含50 mmol L Tris HCL pH7 0 10 mmol L MgC12 10 mmol L果糖 3 mmol L UDPG 中 加入100uL酶液 30 水浴中 反应10 min 加入2 mol L NaOH 0 05mL 沸水煮10 min 流水冷却 再加入1 5 mL浓盐 酸和0 5 mL 0 1 的间苯二酚 摇匀后置于80 水浴保温10 min 冷却后于480nm处比 色测定蔗糖的生成 活性单位以 蔗糖nmol g min Fw 表示 SPS活性的测定 活性的测定 在蔗糖合成酶反应体系中用10 mmol L果糖 6 磷酸取代10 mmol L果糖 其余均按蔗糖合成酶的方法 活性单位以 蔗糖umol g h Fw 表示 药品配制 按药品配制 按100份 份 酶液提取酶液提取 1 配制缓冲液A 1000ml 200mmol L Tris HC1 500ml 200m mol L Tris 12 1g 500ml蒸馏水 200m mol L HC1 L 8 36ml盐酸 37 加水491 63ml水 将 250 ml Tris 233 5 ml HC1 在此液中加入MgC12 分子量95 21 0 9521g EDTA Na2 含两个结晶水分子量372 g 巯基乙醇 分子量78 ml 乙二醇 分子量 ml 最后加蒸馏水定容到1000ml 2 配制缓冲液配制缓冲液B 1000ml 5 ml 12 5ml Tris 11 65ml HCl 加入MgC12 0 0238g 果糖 259 19分子量 0 1296g 加入 UDPG Uridine 5 diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量 610 27 19 1ug 定容到25ml 容量瓶 12 5ml Tris 11 65ml HCl 加入MgC12 0 0238g 加入果糖 6 磷酸 304 1分子量 0 03041g UDPG Uridine 5 diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610 27 19 1ug 定容到25ml 容量瓶 3 2 mol L NaOH 50ml 0 4g 定容至50 ml 4 0 1 的间苯二酚 1g 999ml 蒸馏水 5 做蔗糖标准曲线 做蔗糖标准曲线 植物组织植物组织 ATP 酶活性测定酶活性测定 一 原理 ATP 酶 adenosinetriphosphatase 可催化 ATP 水解生成 ADP 及无机磷的反应 这一 反应放出大量能量 以供生物体进行各需能生命过程 它存在于生物细胞的多个部位 比 如细胞质膜上 叶绿体类囊体膜上 对整个生命的维持有着重要的作用 在生物学研究中 常通过测定酶促反应释放的无机磷量或 ATP 的减少量以及 pH 变化等来测定 ATP 酶的活 力 本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因子 ATPase 的活力 偶联因子是分布在叶绿体类囊体膜表面的一种复合蛋白 它在光合作用能量转换反应中 起重要作用 在正常情况下 膜上的偶联因子催化光合磷酸化反应 ATP 合成 的速率很 高 而水解 ATP 的活力是十分低的 但用二硫苏糖醇 DTT 胰蛋白酶或较高温度等激 活后 它水解 ATP 的活力可大大增加 因此 偶联因子的测定常用激活后的 ATPase 水解 ATP 的活力来表示 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 新鲜菠菜 10g 洗净 去叶柄和中脉备用 二 仪器设备 1 分光光度计 2 水浴锅 3 照光设备 光源 50 000Lx 4 台式离心机 三 试剂 1 Tris HCl 缓冲液 1mol L pH8 0 称 60 57g Tris 溶于 400ml 蒸馏水 中 用浓盐酸调至 pH8 0 再加蒸馏水至 500ml 2 5mol L 硫酸溶液 取 27 8ml 比重 1 84 浓硫酸 慢慢加入到 70ml 蒸馏水中 冷却后定容至 100ml 3 10 硫酸钼酸铵溶液 称 10g 钼酸铵溶于 100ml5mol L 硫酸中 4 硫酸亚铁 钼酸铵试剂 称 5g 硫酸亚铁 加入 10ml 硫酸钼酸铵 再加蒸馏水稀释到 70ml 直至溶解为止 用前临时配制 5 ST N 缓冲液 将 0 05mol L Tris HClpH7 8 缓冲液 内含 0 4mol L 蔗糖 0 01mol L NaCl 放 入冰箱中预冷 三 实验步骤 一 叶绿体制备及叶绿素含量测定 取准备好的菠菜叶 5g 置于研钵或组织捣碎机杯中 加入 20ml0 下预冷的 STN 缓 冲液 很快研磨或捣碎 0 5min 完成 作成匀浆 以四层纱布过滤去粗渣 滤液于 0 2 下 200 g 离心约 1min 去细胞碎片 将上清液再于 1500 g 离心 5 7min 取沉淀悬浮 于少量 STN pH7 8 中 使叶绿素含量在 0 5mg ml 左右 小麦 水稻均可以此介质制叶 绿体 如以甜菜叶子作材料 则匀浆介质中还应加入 0 02mol L 抗坏血酸钠 一般取 0 1ml 叶绿体 加 0 9ml 水和 4ml 丙酮 分析纯 离心 取上清液于 652nm 测吸光度 按 Arno n 公式计算 叶绿素含量 A652 1000 5 34 5 1000 0 1 A652 1 45mg ml 二 ATP 酶的激活 1 Mg2 ATP 酶激活液及反应液配制 2 激活过程 取已制备好的叶绿体悬浮液 1ml 叶绿素含量约为 0 1mg ml 加入 1 ml 激活液 于室温在白炽光 50000Lx 下进行光激活 6min 3 反应过程 取三只试管 分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各0