乳酸菌菌种的分离筛选方法

1 乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称 为兼性厌氧菌为兼性厌氧菌 杆 杆 状或球状 状或球状 革兰氏阳性菌 无芽孢 不运动 营养要求高 需要提供丰富的肽 类 氨基酸 维生素 在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌 干酪乳杆菌 植物乳杆菌 嗜酸 乳杆菌 粪肠球菌 乳酸片球菌 双歧杆菌 屎肠球菌 戊糖片球菌等 乳杆菌常用 MRS 琼脂作半选择培养基 当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时 SL 培养基常用作为选择性培养基 对于芽孢乳杆菌常用 GYP 培养基 链球 菌有 TYC 培养基 MS 培养基 M17 培养基被用作乳球菌的分离培养基 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种 其特性为 杆菌 两端圆 不运动 无 鞭毛 粪肠球菌为革兰氏阳性 圆形或椭圆形 乳酸片球菌细胞呈球状 直径 0 6 1 0 m 在直角两个平面交替形成四联状 一般细胞成对生 单生者罕见 不成链状排列 革兰氏阳性 不运动 兼性厌 氧 在 MRS 培养基上菌落小 呈白色 沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落 不易观察 所以分离时先富集培养 并选择合适的培养基 分离培养基一般添加西红柿 酵母膏 吐温 80 等物质 也常常加入醋酸盐 因醋酸盐能抑制部分细菌生长 对乳酸菌无害 培养基中添加碳酸钙 乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈 作为分离鉴别 的依据 通过对生成的乳酸量进行性能鉴定 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸 维生素及微氧 一般菌落比较小 分离培 养基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质 均具有促进生长作用 也常 常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长 对乳酸菌无害 一一 筛选方法 筛选方法 1 1 溶钙圈法 溶钙圈法 利用一些产酸类细菌在含利用一些产酸类细菌在含 CaCO3CaCO3 的培养基上产生的培养基上产生 CaCO3CaCO3 溶解圈 从而筛选出这溶解圈 从而筛选出这 些产酸类细菌 可用于乳酸菌的筛选 些产酸类细菌 可用于乳酸菌的筛选 其中培养基中加入其中培养基中加入 CaCO3CaCO3 的作用是 的作用是 鉴别能产生酸的细菌 鉴别能产生酸的细菌 中和产生的酸 中和产生的酸 以维持培养基的以维持培养基的 PHPH 筛选过程 样品预处理筛选过程 样品预处理 梯度稀释至梯度稀释至 10 6 10 6 选择合适的稀释度涂布选择合适的稀释度涂布 37 37 培养培养 2 48h 48h 挑选产生溶钙圈的菌落反复在挑选产生溶钙圈的菌落反复在 MRSMRS 培养基上划线培养基上划线 挑起单菌落染色 经镜挑起单菌落染色 经镜 检确认为纯种检确认为纯种 挑选革兰氏阳性单菌落挑选革兰氏阳性单菌落 试管穿刺试管穿刺 4 4 冰箱保存 冰箱保存 2 2 溴甲酚绿指示剂法 溴甲酚绿指示剂法 培养基 培养基 MRSMRS 培养基 含溴甲酚绿酒精溶液 培养基 含溴甲酚绿酒精溶液 筛选过程 同上 不同之处是稀释涂布后长出菌落 挑取使溴甲酚绿变色的菌筛选过程 同上 不同之处是稀释涂布后长出菌落 挑取使溴甲酚绿变色的菌 落 落 二 菌种的分离筛选菌种的分离筛选 1 1 培养基 培养基 1 1 麦芽汁碳酸钙培养基 麦芽汁 10BX 1L 预先灭菌碳酸钙 5 10g L PH 自然 分离用 1 2 牛肉膏 10g L 蛋白胨 10g L 酵母膏 10g L 番茄汁 200g L 葡萄糖 10g L 吐温 0 05 CaCO315 20g L 溴甲酚绿 0 01 PH6 0 6 5 分离用 1 3 番茄汁碳酸钙培养基 酵母膏 7 5 g L 葡萄糖 10 g L 番茄汁 100mL 蛋白胨 7 5g L KH2PO4 2 0 g L 吐温 0 5 mL PH 6 0 6 5 分离用 1 4 葡萄糖 20g L 酵母膏 10g L PH 6 0 6 5 1 5 蛋白胨 8 10 g L 酵母膏 3 5g L 葡萄糖 13 15g L KH2PO4 1 5 2 0g L MgSO4 0 3 0 5 g L MnSO4 0 2 0 25g L NaAC 3 0 5 0g L PH 5 5 6 5 1 6 蛋白胨 0 8 1 0g L 糖蜜 3 0 5 0g L 酵母膏 3 5g L 玉米浆 0 5 1 0g L KH2PO4 0 1 0 3g L MgSO4 0 3 0 5g L NaC13 5g L 葡萄糖 8 10g L PH5 5 6 5 发酵或种子培养基 1 7 MRSMRS 培养基培养基 分离培养计数用 分离培养计数用 蛋白胨蛋白胨 10 0g10 0g 牛肉膏 牛肉膏 10 0g10 0g 酵母膏酵母膏 5 0g5 0g 柠檬酸氢二铵柠檬酸氢二铵 2 0g2 0g 葡萄糖葡萄糖 20 0g20 0g 吐温吐温 8080 1 0mL1 0mL 乙酸钠乙酸钠 5 0g5 0g 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2 0g2 0g 硫酸镁 硫酸镁 0 58g0 58g 硫酸锰 硫酸锰 0 25g0 25g 琼脂 琼脂 18 0g18 0g 蒸馏水蒸馏水 1L 1L pHpH 6 56 5 分离培养基 分离培养基 当当 MRSMRS 培养基冷却至培养基冷却至 4545 50 50 时时 加入已灭菌的碳酸钙加入已灭菌的碳酸钙 充分混匀充分混匀 倒平板 倒平板 1 81 8 BCPBCP 培养基 培养基 溴甲酚紫培养基 乳糖乳糖 5 0g5 0g 蛋白胨蛋白胨 5 0g5 0g 酵母膏酵母膏 3 0g3 0g 0 5 0 5 溴甲酚紫 10ml 自来水 1000ml pH6 5 7 0pH6 5 7 0 分离用 分离用 3 1 91 9 BCGBCG 牛乳营养琼脂牛乳营养琼脂 脱脂奶粉 脱脂奶粉 10g10g 溶于 溶于 5050ml 水中 加入 1 6 溴甲酚绿 酒 精溶液 0 07ml 0 075Mpa 20min 另取琼脂 2 0g g 溶于 溶于 5050ml 水中 加酵母膏 1 0g g 溶解后调 pH6 5 6 8pH6 5 6 8 0 10 1 Mpa 20min 趁热在无菌操作下两者混合均匀 倒平板 37 培养 24h 检查是否有杂菌 2 2 分离筛选分离筛选 2 12 1 富集培养富集培养 取 取 1 0g1 0g 1 01 0ml 于无菌细口瓶中 加入无菌 于无菌细口瓶中 加入无菌麦芽汁液体培养液 于瓶口处 密闭 25 32 培养 48h 若培养基表内出现绢丝波纹物 镜检杆状 革兰氏阳性 初步定为乳酸菌 以同样方法转接 2 3 次 接种量 3 5 2 2 菌种分离纯化 溶钙圈法 溶钙圈法 富集菌液或样品适当稀释至 10 7 混菌法分离 先加入 10 12ml MRSMRS 培养基培养基 或或 麦芽汁培养基 凝固后再注入 4 5ml 水琼脂培养基 制成厌氧环境 30 或 37 培养 2 3 天 温度低时间稍长 可出现针头状或圆形稍扁菌落 周围形成 透明圈 挑取透明圈大 培养基变黄的菌落 反复划线纯化 2 3 次 所得单菌 落编号 经镜检后 疑似乳酸菌落接种于 MRSMRS 培养基培养后培养基培养后保存备用 或接入 液体培养基中 25 32 培养 24 48h 然后穿刺于 MRSMRS 培养基或培养基或麦芽汁碳酸钙 半固体培养基中 25 32 培养 48h 保存备用 2 3 性能测定 乳酸菌定性试验 不同条件下的产酸速率试验 将分离菌种接种于 MRSMRS 液体培养基中液体培养基中 2525 37 温度下培养测不同菌株不同温度的 pHpH 4 方法方法 1 1 吸取发酵液吸取发酵液 1010ml 注入空试管中 加入 10 硫酸 1 0ml 在加入 2 0 高锰酸钾约 1 0ml 此时乳酸转化成乙醛 取滤纸一条 在含氨的硝酸银 溶液中浸湿 横搭在试管口上 将试管徐徐加热至沸腾 使乙醛挥发 若管口 滤纸变黑 证明有乳酸生成 方法 2 纸层析法 展开剂为正丁醇 甲醇 水 80 15 5 毛细血管吸取发酵 液 多次点样于新华滤纸上 1 5 标准乳酸为对照 平衡 2 小时后进行层析 3 溴甲酚蓝显色计算 Rf 值 产酸量测定 5 05 0ml 发酵液于 150ml 三角瓶中 加中性蒸馏水 10 20ml 酚酞指 示剂 2 滴 用 0 1mol l 氢氧化钠滴定至微红色 醋酸量 g 100mL 氢氧化钠摩尔浓度 Vx90 08x10 3 样品毫升数 x100 同时 进行单因素试验 分别考察醋酸速度 耐高温 耐酒精度 耐低酸度等 主要生产性能 选择优势菌株 3 菌株鉴定 3 1 菌落形态 3 2 菌体形态 革兰氏染色观察 染色镜检 杆状 阳性 3 3 乳酸菌运动性检测 半固体穿刺法 3 4 生理生化 3 3 1 生化试验 产过氧化氢 产硫化氢 葡萄糖产生 硝酸盐还原 产生吲 哚 甲基红 明胶液化 需氧 精氨酸 糖发酵试验 3 3 2 生理试验 乳酸菌产酸能力曲线 将筛选的乳酸菌接种于 MRSMRS 液体培养基中 液体培养基中 25 32 培养 48h 间隔 4 6h 测定发酵液 pHpH 5 食盐对乳酸菌的影响食盐对乳酸菌的影响 在 在 MRSMRS 液体培养基中 添加液体培养基中 添加 0 0 0 0 2 0 2 0 4 0 4 0 6 0 6 0 氯化钠 菌种分别接种于培养基中 氯化钠 菌种分别接种于培养基中 32 培养 48h 测定 OD 值 溴甲酚绿指示剂法 溴甲酚绿指示剂法 原理 溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色 碱性环境呈蓝色 分离培养基配原理 溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色 碱性环境呈蓝色 分离培养基配 制后制后 PH 为 6 8 加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色 产酸后菌落周围变成黄色 较溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色 产酸后菌落周围变成黄色 较 容易鉴别 容易鉴别 培养基 培养基 BCGBCG 牛乳营养琼脂牛乳营养琼脂 初筛 初筛 将样品富集液梯度稀释 适温培养 平板上出现扁平的黄色菌落及周围将样品富集液梯度稀释 适温培养 平板上出现扁平的黄色菌落及周围 培养基也为黄色初定为乳酸菌 培养基也为黄色初定为乳酸菌 复筛复筛 将典型菌落转接脱脂乳发酵管 若凝固 无气泡 呈酸性 镜检细胞杆 将典型菌落转接脱脂乳发酵管 若凝固 无气泡 呈酸性 镜检细胞杆 状或链球状 革兰氏染色阳性 连续传代若干次培养 挑选出状或链球状 革兰氏染色阳性 连续传代若干次培养 挑选出 3 43 4h 能凝固的乳能凝固的乳 管保存备用 管保存备用 注 注 1 1 乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行 乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行 分别在分别在麦芽汁碳酸钙培养基 番茄汁碳酸钙培养基 BCPBCP 培养基 培养基 溴甲酚紫培 养基 同时进行混菌 同时进行混菌 划线或涂布培养 放厌氧袋 分别划线或涂布培养 放厌氧袋 分别 2525 37 培养 48h 菌落观察 平板表面形成浅色 黄色或白色 小菌落 麦芽汁碳酸钙培养基表 面 菌落周围形成透明圈 BCPBCP 培养基 培养基 溴甲酚紫培养基 周围使紫色的培养 周围使紫色的培养 基形成黄色包围圈 基形成黄色包围圈 触酶反应触酶反应 厌氧菌一般无触酶 过氧化氢酶 用滴管滴加厌氧菌一般无触酶 过氧化氢酶 用滴管滴加 3 0 3 0 过氧化氢于过氧化氢于 菌落上 若无气泡产生 证明该菌为触酶阴性 菌落上 若无气泡产生 证明该菌为触酶阴性 将各种特征菌落分别接入斜面 培养后保存 进一步生理生化试验 以鉴定分将各种特征菌落分别接入斜面 培养后保存 进一步生理生化试验 以鉴定分 别何种乳酸菌 别何种乳酸菌 6 2 菌落鉴定 半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长 菌落出现早 2 1 菌落形态观察 乳白色 边缘不整齐 稍呈半球状凸起 实心菌落 个体形态 半透明 细杆状 链状排列 大量时呈发丝状堆积 初步认为乳杆 菌 2 2 生化鉴定 在吲哚试验中 加入菌种试管无任何变化 为阴性反应 说明 该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力 明胶液化 淀粉水解 氢氧化钾试验均 为阴性 说明此菌为乳酸菌 过氧化氢酶 还原硝酸盐 糖发酵试验 发酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖产酸为阳性反应 其余麦芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖产酸为阴性反应 根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏 乳杆菌保加利亚亚种 纤维二糖 甘露醇 山梨醇 七叶苷 水杨苷 2 3 乳酸菌生长曲线 pH tpH t 测定结果 测定结果 7 8 三 几种乳酸菌筛选举例几种乳酸菌筛选举例 1 1 嗜热链球菌 样品来源 市售酸奶嗜热链球菌 样品来源 市售酸奶 培养基 培养基 M17M17 改良培养基 培养温度 改良培养基 培养温度 42 42 需氧情况 兼性厌氧 筛选方法 常规的稀释涂布和划线分离 需氧情况 兼性厌氧 筛选方法 常规的稀释涂布和划线分离 9 2 2 保加利亚乳杆菌 保加利亚乳杆菌 样品来源 市售酸奶 培养基 牛肉