IVF实验室的基本操作.ppt

IVF实验室的基本操作 实验室操作原则 辅助生殖技术基本操作 培养液的准备 培养液的基本组分无机盐离子 维持pH和渗透压碳水化合物 能量来源蛋白质来源抗生素矿物油有利于维持培养液温度 pH值和渗透压稳定防护屏障 减少污染吸收脂溶性毒素防止液体蒸发 培养液的准备取卵前一日下午进行 原则 高效 方便 安全 经济四孔培养皿 卵处理精液所需培养液微滴培养 受精卵 胚胎胚胎移植液 37 5 或6 CO2培箱内平衡过夜 卵母细胞的获取 注射hCG后36 38小时取卵阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡核对姓名解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物OCCC37 5 6 CO2培养操作迅速 避光 精液处理 正常精液 同IUI极度少精 增加离心力死精症 低渗肿胀实验附睾穿刺精子 睾丸穿刺或活检精子 1ml注射器针头挑碎组织 离心悬液附睾 睾丸精子的冷冻 常规受精 适应症 精液正常 轻度少 弱精症受精率 65 80 MII卵 受精时间 长受精 短受精 卵母细胞浆内单精子显微注射 适应症 严重少弱精 梗阻性无精 畸精症 既往IVF常规受精失败史 某些不明原因不孕等时间 取卵后2小时剥卵 利用透明质酸酶 80mIU ml 和机械法剥除颗粒细胞 卵母细胞浆内单精子显微注射 卵母细胞成熟度的评价 GV MI MII 卵母细胞浆内单精子显微注射 操作滴的准备 7 PVP加精装针显微注射受精率 70 受精方式的选择 ICSI的安全性 逃避了自然选择过程垂直传递遗传缺陷操作过程对配子的损伤严格掌握ICSI适应症 非男性因素不孕ICSI治疗结局 非男性因素不孕症 ICSI未显现出优势 检查受精 时间 受精后15 18小时机械法除去颗粒细胞及放射冠正常受精 两个原核 两个极体 合子形态评价 原核的大小 位置及方向核仁前体的数目 大小 分布胞浆的外观早期卵裂情况 异常受精 1PN 发生率1 5 卵裂率74 染色体二倍体率5 囊胚形成率29 Noyes2008 机制 雌雄原核发育不同步雌雄原核融合孤雌来源ICSI多见 异常受精 多PN 发生率 IVF5 8 ICSI1 发生机制 2精子进入第2极体滞留双倍体卵母细胞 未见原核 未受精 可能机制卵母细胞未成熟卵母细胞染色体异常卵裂率 10 染色体二倍体率3 优胚率低 12 38 囊胚形成 0 12 Noyes2008 受精失败 受精率 20 受精率低下所有成熟卵均未受精受精失败常规受精周期失败率10 精子功能障碍卵母细胞成熟障碍补打ICSI ICSI周期失败率2 3 严重精子畸形卵母细胞激活钙离子载体 机械激活 胚胎培养 胚胎质量评价 胚胎评价标准细胞数碎片 无碎片碎片50 卵裂球均匀程度 囊胚的评分体系 4AA 囊胚腔的大小 内细胞团细胞分级 滋养层分级 三位评分法 1 不到整个胚胎的一半2 超过了胚胎体积的一半3 完全占据整个胚胎4 扩张囊胚5 孵化囊胚6 孵化后囊胚 A包裹紧密 大量细胞B结构松散 少量细胞C极少量细胞 A许多细胞紧密结合B少量细胞 结构松散C极少量细胞 2AA 5AA 4BA 4CC 胚胎移植操作 选择需要移植的胚胎 移入移植滴内35岁以下 首次移植的病人移植2枚胚胎35岁以上 或非首次移植的病人移植3枚胚胎确认核对患者姓名D3orD5移植 移植液 移植液 移植液和胚胎 气 20 l 气 胚胎移植操作 胚胎冷冻 意义 提高累计妊娠率 避免多胎 减少卵巢过度刺激风险温度的急剧变化形成冰晶机械性损伤溶质性损伤渗透压损伤核心 避免冰晶形成冷冻方法 慢冻速融法玻璃化冷冻法冷冻保护剂渗透性保护剂 EGPRON甘油非渗透性保护剂 蔗糖大分子物质 胚胎的冷冻 慢速冷冻 1 5M丙二醇0 1M蔗糖 慢冻速融法 冷冻程序20 7 3 min 7 人工植冰 7 30 0 3 min 30 120 30 min 胚胎复苏 1 2 3 4 0 5M丙二醇0 2M蔗糖5min 0 2M蔗糖5min PBS5min 1 0M丙二醇0 2M蔗糖5min 预防冰晶的再形成复苏程序 室温40s 30 水浴1min 胚胎冻融损伤 复苏胚胎评价 50 卵裂球完整存活复苏率 90 无损伤胚胎着床率高部分损伤胚胎着床能力下降 玻璃化冷冻 原理条件 高浓度冷冻保护剂极快的降温速度载体 开放式密闭式适应症 卵母细胞囊胚优点 复苏率高 其他技术 IVM 未成熟卵母细胞体外成熟 IVM 优点 简便经济避免OHSS体外