酶工程考试重点整理

标志酶标志酶 通常可以将只分布于细胞内某个特定组分的酶称为标志酶 可以将它作为细胞组分鉴别的依据 甚至 可以判别组织或器官是否发生病变 必需水必需水 在有机介质中 酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象 一般将维持酶分子完整空间构象所 必须的最低水含量称为必需水 沉淀分离沉淀分离 是通过改变某些条件或添加某些物质 使酶的溶解度降低 从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技 术过程 超滤超滤 需要增加流体的静压力 改变天然过程的方向 才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜 此时的 推动力是流体静压力与渗透压的压差 差速离心差速离心 是指采用不同的离心速度和离心时间 使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法 非竞争性抑制非竞争性抑制 抑制剂与底物分别于酶分子上的不同点结合而引起酶活性降低的抑制作用 反竞争性抑制反竞争性抑制 在底物与酶分子结合生成中间复合物后 抑制剂在于中间复合物结合而引起的抑制作用 反渗透反渗透 是一种以压力差为推动力 从溶液中分离出溶剂的膜分离操作 孔径范围在 20 由于分离的溶剂分 子往往很小 不能忽略渗透压的作用 故而成为反渗透 反胶束 反胶束 当体系中水浓度低于有机溶剂时 形成胶束的表面活性剂的极性端朝向胶束的中部 而非极性端则 朝向胶束的外侧 水就被包在了胶束的内部 此时的胶束就叫反胶束 固定化酶固定化酶 与水不溶性载体结合 在一定的空间范围内起催化作用的酶 优点优点 纯化简单 提高产物质量 应用范 围广 多次使用 可以装塔连续反应 缺点缺点 首次投入成本高大分子底物较困难 方法方法 吸附法 包埋法 凝胶 半透 膜包埋法 结合法 离子键 共价键结合法 交联法 热处理法 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 酶本身的变化 载体 的影响 固定化方法的影响 固定化酶活性损失的原因固定化酶活性损失的原因 酶本身的失活 酶从载体上脱落 载体的破碎或溶解 固定化酶的性质固定化酶的性质 固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适 pH 的变化 最适温度变化 底物特异 性与游离酶不同 米氏常数 Km 的变化 共阻遏物共阻遏物 酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产物使该酶的生物合成受阻 引起反馈阻遏的物质 称为共 阻遏物 竞争性抑制竞争性抑制 指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起带的抑制作用 它与酶作用底物的结构相似 与酶分子 结合以后 底物分子就不能与酶分子结合 从而对酶的催化到抑制作用 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子 使酶的催化特性发生改变的修饰方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法 PAGE 应用广泛 可用于蛋白 质 酶 核酸等生物分子的分离 定性 定量及少量的制备 还可测定分子量 等电点等 酶工程酶工程 酶的生产 改性与应用技术过程 酶活力酶活力 酶的催化能力 以酶促反应速度来衡量 测定条件测定条件 适宜的特定的反应条件 样品的适当处理 底物浓度 足够大 酶活力单位酶活力单位 指酶促反应在单位时间 s min h 内生成一定量 mg g mol 的产物或只记的分支结构可能消耗 一定量的底物所需的酶量 酶活力测定方法如化学测定法 光学测定法 气体测定法等 酶的抑制剂酶的抑制剂 能够使酶的催化活性降低或者丧失的物质 在抑制剂作用下 酶的催化活性降低甚至丧失 从而影 响没的催化功能 有可逆和不可逆抑制剂 酶的可逆抑制剂分为竞争性抑制 非竞争抑制 反竞争抑制 酶的发酵生产酶的发酵生产 经过预先设计 通过人工操作 利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程 称为酶的发酵 生产 酶的提取酶的提取 是指在一定的条件下 用适当的溶剂或溶液处理含酶原料 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程 也 称为酶的抽提酶的抽提 酶的分离纯化酶的分离纯化 是采用各种生化分离技术 诸如 离心分离 过滤与膜分离 萃取分离 沉淀分离 层析分离 电泳分 离 以及浓缩 结晶 干燥等 使酶与各种杂质分离 达到所需的纯度 以满足使用的要求 酶反应器酶反应器 酶和固定化酶在体外进行催化反应时 都必需在一定的反应容器中进行 以便控制酶催化反应的各 种条件和催化反应的速度 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器酶反应器 酶反应器是用于完成酶 促反应的核心装置 它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件 以便在酶的催化下 使底物 原料 最 大限度地转化成产物 它处于酶催化应过程的中心地位 是连接原料和产物的桥梁 类别类别 分批搅拌反应器 连 续流搅拌桶反应器 连续搅拌桶 超滤反应器 填充床反应器 循环反应器 流化床反应器 酶传感器酶传感器 是间接型传感器 它不是直接测定待测物质的浓度 而是利用酶的催化作用 在常温常压下将糖类 醇类 有机酸 氨基酸等生物分子氧化或分解 然后通过测定与反应有关的物质浓度 进而推出相应的生物物质 浓度 酶定向进化技术酶定向进化技术 是模拟自然进化过程 在体外进行基因的随机突变 建立突变基因库 通过人工控制条件的特 殊环境 定向选择得到具有优良特性的酶的突变体的技术过程 它不需要是想了解酶的结构催化功能 作用机 制等有关信息 应用面广 通过易错 PCR DNA 重排 基因重排等技术 在体外人为的进行基因的随机突变 短时 间内可以获得大量不同的突变基因 建立突变基因库 在人工控制条件的特殊环境下进行定向选择 进化方向 明确 目的性强 酶的定向进化史一种快速有效的改进酶的催化特性的手段 通过每的定向进化 有可能获得具 有优良特性的新酶分子 酶分子修饰酶分子修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶酶 分子修饰分子修饰 即 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团 物质 特别是具有生物相容性的物质 进行共 价连接 从而改变酶的结构和性质 其生物学意义生物学意义提高酶的活力 增强酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性 研 究和了解酶分子中主链 侧链 组成单位 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 pH 记忆记忆 将酶分子从水溶液转移到有机溶剂中 酶能保持原有的离子化状态 此时的环境因素也不能改变酶 分子的这种状态 或者说酶在缓冲液中所处的 pH 状态仍被保持在有机溶剂中的这种现象 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 主要用于分离 鉴定核酸 如 DNA 鉴定 DNA 限制性内切酶图谱制作等 为 DNA 分子及其片 段分子量测定和 DNA 分子构象的分析提供了重要手段 琼脂糖凝胶电泳的基本操作基本操作 1 配制缓冲液贮备液 水平型琼脂糖凝胶制备 3 样品的制备与点样 电泳 染色 样品回收 提取分离法提取分离法 是采用各种提取 分离 纯化技术从动物 植物的组织 器官 细胞或微生物细胞中将酶提取出来 再 进行分离纯化的技术过程 修饰修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液 以一定的比例混合 在一定的温度 pH 值等条 件下反应一段时间 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合 对酶分子进行修饰 盐析沉淀法盐析沉淀法 在高浓度的中性盐存在下 蛋白质类酶在水溶液中的溶解度降低 产生沉淀的过程 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂 降低溶质的溶解度 使其沉淀析出 酶分子修饰包括酶分子修饰包括金属离子置换修饰 大分子结合修饰 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 核苷酸链有限水解修 饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰 修饰剂的选择修饰剂的选择 大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子 例如 聚乙二醇 PEG 右旋糖酐 蔗糖聚合物 Ficoll 葡聚糖 环状糊精 肝素 羧甲基纤维素 聚氨基酸等 要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的 水溶性大分子 修饰剂的活化修饰剂的活化 作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起 在使用之前 一般需要经过活化 然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应 金属离子置换修饰过程和作用金属离子置换修饰过程和作用 过程过程 1 酶的分离纯化 2 除去原有的金属离子 3 加入置换离子作用作用 1 阐明金 属离子对酶催化作用的影响 2 提高酶催化效率 3 增强酶稳定性 4 改变酶的动力学特性 影响酶催化作用的因素影响酶催化作用的因素 底物浓度 酶浓度 抑制剂 温度 PH 激活剂 酶发酵生产常用的微生物有哪些酶发酵生产常用的微生物有哪些 简介产酶性质简介产酶性质 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉 毛霉 链霉菌 啤酒酵母 假丝酵母 特点特点 1 酶的产量高 2 用以培养和管理 3 产酶稳定性好 4 利于酶的分离纯化 5 安全可靠 无毒性 简述发酵工艺条件是如何调节控制的简述发酵工艺条件是如何调节控制的 细胞活化与扩大培养 活化 使用以前 必须接种于新鲜的斜面培养基 上 在一定条件下进行培养 以恢复细胞的生命活动能力 扩大培养 增加发酵时的数量 经过一级至数级扩大 培养 培养基称为种子培养基 培养基的配制 培养基 广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖 所 需的一组营养物质和原料 同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件 pH 值的调节控 制 培养基中的 pH 值与微生物生命活动有着密切关系 各种微生物有其可以生长的和最适生长的 pH 范围 温度的调节控制 通常在生物学范围内每升高 10 生长速度就加快一倍 所以温度直接影响酶反应 对于微 生物来说 温度直接影响其生长和合成酶 溶解氧的调节控制 微生物对氧的需要不同 是由于依赖获得能量 的代谢方面的差异 种龄与接种量 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜 接种量的大小直接影响发酵周 期 提高酶产量的措施有哪些提高酶产量的措施有哪些首先要选育或选择使用优良的产酶细胞 打破酶合成调节限制的方法 1 通过条件 控制提高酶产量 添加诱导物 降低阻遏物浓度 2 通过基因突变提高酶产量 使诱导型变为组成型 使阻遏型变 为去阻遏型 3 其它提高酶产量的方法 添加表面活性剂 添加产酶促进剂 酶生物合成模式有哪些酶生物合成模式有哪些 同步合成型同步合成型 又称生长偶联型 是指酶合成与细胞生长同步进行 当细胞生长进入对数期时 酶也大量合成 当 细胞进入稳定期时 酶的合成也停止 该类型酶的生物合成可以有其诱导生成 不受分解代谢物的阻遏和产物 的反馈阻遏作用 mRNA 很不稳定 延续合成型延续合成型 酶的合成伴随着细胞生长而开始 但在细胞生长进入稳定期后 酶的合成仍将延续较长一段时 间 酶的生物合成可以受诱导物的诱导 不受分解代谢物阻遏 mRNA 相当稳定 中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始 而在细胞生长进入稳定期后 酶的合成也终止 酶的生物 合成受到产物反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用 mRNA 稳定性较差 滞后合成型滞后合成型 只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累 主要受培养基中存在的阻遏物的阻 遏作用 mRNA 稳定性较好 影响酶生物合成模式的因素主要是什么影响酶生物合成模式的因素主要是什么 mRNA 的稳定性和培养基中存在的阻遏物 mRNA 稳定性高的 可以 在细胞停止生长后继续合成相应的酶 mRNA 稳定性差的 随着细胞生长停止而终止酶的合成 不受阻遏物阻 遏的 可随着细胞生长而开始酶的合成 受阻遏物阻遏的 要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏 才 能开始酶的合成 简述固定化细胞发酵产酶的特点以及工艺条件的控制简述固定化细胞发酵产酶的特点以及工艺条件的控制优点优点 提高产酶率 基因工程菌的质粒稳定 不易丢失 不溶于水 易于与产物分离纯化 可反复使用或连续使用较长时间 可连续化生产 发酵稳定性好 适用于胞外 酶等胞外产物的生产 缩短发酵周期 提高设备利用率 缺点缺点 固定化过程中往往会引起酶的失活 工艺条件控制工艺条件控制 固定化细胞的预培养 为了使固定化细胞生长良好 预培养应该采用适合细胞生长的生长培养 基和工艺条件然后改换成适合产酶的发酵培养基和发酵工艺条件 溶解氧的供给 必须增加溶解氧的量才能 满足细胞生长和产酶需要 温度的控制 一般培养液在进入反应器之前 必须预先调节至适应的温度 培养基 组分的控制 固定化细胞好氧发酵过程中 溶解氧的供给时关键限制性因素 为了有利于氧的溶解和传递 培氧 基的浓度不宜过高 特别是培养基的年度应尽量低一些好 细胞破碎法细胞破碎法 机机械法 捣碎 研磨 匀浆 物理法 温度差 压力差 超声波 化学法 添加有机溶剂 表面活性剂 酶 促法 自溶法 外加酶制剂法 等 酶的主要提取方法酶的主要提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取影响提取的因素影响提取的因素 温度 PH 提取液体积 什么是沉淀分离 常用蛋白质沉淀方法有哪些什么是沉淀分离 常用蛋白质沉淀方法有哪些沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质 使酶的溶解 度降低 从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程 特点特点 操作简单 经济 浓缩倍数高 种类种类 盐析沉淀法 等 电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法等 缺点缺点 针对复杂体系而言 分离度不高 选择性 不强 沉淀分离的一般操作步骤是什么沉淀分离的一般操作步骤是什么在经过滤或离心后的样品中加入沉淀分离剂 沉淀物的陈化 促进晶体生长 离心或过滤 收集沉淀物 盐析操作时常用的盐是什么盐析操作时常用的盐是什么通常采用中性盐中性盐 有硫酸铵 硫酸钠 硫酸钾 硫酸镁 氧化钠和磷酸钠等 其中硫酸 铵最为常用 只是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小 不影响酶的活性 分力效果好 而且廉价易得 然而用硫酸铵进行盐析是 缓冲能力较差 而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定 所以有时也用其他中性 盐进行盐析 影响盐析的主要因素有哪些影响盐析的主要因素有哪些质种类的影响 Ks 和 值 溶质浓度的影响 蛋白质浓度大 盐的用量小 但共沉作 用明显 分辨率低 蛋白质浓度小 盐的用量大 分辨率高 pH 值 影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系 pH 值 使其在 pI 附近 盐析温度 大多数情况下 高盐浓度下 温度升高 其溶解度反而下降 机溶剂沉淀法的原理是什么 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些机溶剂沉淀法的原理是什么 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些 原理原理 1 降低了溶质的介电常数 使溶质之间的静电引力增加 从而出现聚集现象 导致沉淀 2 由于有机溶剂的 水合作用 降低了自由水的浓度 降低了亲水溶质表面水化层的厚度 降低了亲水性 导致脱水凝聚 特点特点 分 辨率高 溶剂容易分离 并可回收使用 产品洁净 容易使蛋白质等生物大分子失活 应注意在低温下操作 成本 高 影响因素 1 温度 低温有利于防止溶质变性 有利于提高收率 溶解度下降 2 搅拌速度搅拌速度 散热 3 溶液溶液 pH 值值 原 则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷 防止共沉现象 4 pI 离子强度 离子强度 离子强度低有利于沉淀 0 01 0 05mol L 5 样品浓度样品浓度 0 5 2 稀 溶剂用量大 回收率低 但共沉淀作用小 浓 节省溶剂用量 共沉淀作用 强 分辨率低 6 金属离子的助沉淀作用金属离子的助沉淀作用 Zn2 Ca2 等电点沉淀的工作原理是什么等电点沉淀的工作原理是什么蛋白质是两性电解质 当溶液 pH 值处于等电点时 分子表面净电荷为 0 双电 层和水化膜结构被破坏 由于分子间引力 形成蛋白质聚集体 进而产生沉淀 分配层析分配层析原理原理 利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 要素要素 固定相 载体 流动相 凝胶层析的原理和特点是什么凝胶层析的原理和特点是什么在样品通过一定孔径的凝胶固定相时 由于流经体积的不同 使不同相对分子 质量的组分得以分离 优点优点 操作简便 分离效果好 重复性高 回收率高 分离条件温和应用广泛 适用于生物大 分子的初级分离 脱盐分辨率低 亲和层析的原理和特点是什么亲和层析的原理和特点是什么亲和层析分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用 从而实现分离 吸附 剂由载体和配位体组成 效率高效率高 利用亲和层析可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质 分离精度分离精度 高 高 可用于分离含量极低 结构相近的化合物但通用性较差 洗脱条件苛刻 吸附层析吸附层析吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力 使其富集在吸附剂表面的过 程 吸附过程通常包括吸附过程通常包括 待分离料液与吸附剂混合 吸附质被吸附到吸附剂表面 料液流出 吸附质解吸回收等 四个过程 什么是萃取过程 常用萃取设备什么是萃取过程 常用萃取设备利用在两个互不相溶的液相中各种组分 包括目的产物 溶解度的不同 从而 达到分离的目的 物理萃取 化学萃取 设备 混合 沉降器 旋转圆筒萃取塔 离心萃取器 填充塔 喷雾塔 旋转圆盘塔 液 液萃取从机理上分析可分为哪两类液 液萃取从机理上分析可分为哪两类萃取机理来讲 液 液萃取可分为 利用溶剂对需分离组分有较高的 溶解能力 分离过程纯属物理过程的物理萃取 溶剂首先有选择性地与溶质化合成络合 从而在两相中重新分 配而达到分离目的的化学萃取 何谓超临界流体萃取 其特点有哪些何谓超临界流体萃取 其特点有哪些 超临界流体 当一种流体处于其临界点的温度和压力之下 则称之为超临界流体 利用超临界流体的特殊性质 使其在超临界状态下 与待分离的物料接触 萃取出目的产物 然后通过降压或升 温的方法 使萃取物得到分离优点优点 临界条件温和产 品分离简单 无毒 无害 不燃 无腐蚀性 价格便宜 缺点 设备投资大 何谓双水相萃取何谓双水相萃取 常见的双水相构成体系有哪些常见的双水相构成体系有哪些利用物质在不相溶的两水相间分配系数差异进行萃取的方 法 可以构成双水相的体系有可以构成双水相的体系有 离子型高聚物 非离子型高聚物 PEG DEXTRAN 右旋糖 高聚物 相对 低分子量化合物 PEG 硫酸铵 反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理 反胶束的优点反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理 反胶束的优点 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时 表面活性剂会在水溶液中形成聚集体 何谓酶定向进化 有何特点何谓酶定向进化 有何特点酶分子定向进化简称酶定向进化酶分子定向进化简称酶定向进化 是模拟自然界进化过程 随即突变和自然选择 在 体外进行酶基因的人工随机突变 建立突变基因文库 在人工控制条件的特殊环境下 定向选择得到具有优良 催化特性的酶的突变体的技术过程 特点 1 适应面广适应面广 可广泛应用各种蛋白质酶和核算类酶的改性 因为不需要事先了解酶的结构 催化作用机制 等 2 目的性强目的性强 因为进化方向明确 3 效果显著效果显著 可以在几年几个月完成几万年几十万年完成的进化历程 什么是酶的活性中心 其构成有什么特点什么是酶的活性中心 其构成有什么特点通常将氨基酸集中的 与酶活性相关的区域称为酶的活性中心 构 成酶的活性中心的氨基酸残基主要是接触残基和辅助残基 构成酶的活性中心的各基团在空间构象上的相 对位置对酶活性是至关重要的 维持酶的活性中心构象主要依赖于酶分子空间结构的完整性 固定化酶有哪些优点固定化酶有哪些优点 1 极易将固定