基因诊断与基因治疗ppt课件.ppt

基因诊断与基因治疗 GeneDiagnosisandTherapy 1 基因诊断 4 18 基因治疗 4 25 2 2013年 H7N9禽流感来袭 快速而准确地对疑似患者作出诊断 能有效的增大患者的生机 通过什么方法作出快速诊断 如何来进行治疗 3 4 48小时内使用最有效 5 利用分子生物学方法 直接检测基因结构及其表达水平是否异常 从而对疾病作出诊断 为治疗提供依据 特点 针对性强 特异性高实用性强 诊断范围广预见性 适应性 基因诊断 6 基因诊断常用技术方法 一 核酸分子杂交技术 二 聚合酶链反应 PCR 三 基因测序 四 基因芯片 7 核酸分子杂交技术原理 8 Southern印迹杂交法 Southernblotting Northern印迹杂交法 Northernblotting 斑点杂交或狭缝杂交法 Spot Slotblothybridization 菌落杂交 colonyhybridization 夹心杂交法 sandwichhybridization 原位杂交 hybridizationinsitu 常用固相核酸杂交方法 9 1 Southern印迹杂交法 限制性内切酶酶切检测杂交信号提取DNA Southern法可用于检测特异的DNA序列片段 进行基因定位 分子量测定等 10 2 Northern印迹杂交法 其基本过程类似于上述Southern法 提取RNA样本 RNA变性 琼脂糖凝胶电泳分离 转移至膜 探针 标记DNA或RNA 与之杂交 显影或显色 检测信号 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 11 6 原位杂交将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交 进而检测特异的DNA或RNA序列 细胞原位杂交 组织切片原位杂交DNA DNA RNA DNA RNA RNA优点 不需提取核酸 故可完整保持组织或细胞的形态 因而更能准确地反映组织细胞的功能状态 12 二 聚合酶链反应 polymerasechainreactionPCR KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetusco winnerof1993NobelPrize 13 PCR产物以指数形式增加 即Y 2nn为循环数 14 三 基因测序技术 他们给DNA的测序带来了一场革命 分享了1980年的诺贝尔化学奖 后来Sanger法发展为自动化测序法 并为人类基因组测序做出了卓越贡献 FredSanger发明的末端合成终止法 sanger法 WalterGilbert发明的化学裂解法Maxam Gillbert法 15 四 基因芯片技术 快速 高通量 平行化 自动化 16 基因诊断方法 经典基因诊断 限制性内切酶法 RFLP分析法 寡核苷酸分析法 优点 缺点 特异基因诊断未知基因诊断直接 过程简单 过程繁杂准确性低 过程繁条件严格 基因诊断进展 PCR方法 PCR 序列分析法 DNA芯片技术 简单 经济 敏感操作直接 准确集成度高 快速 并行 假阳性高价格高尚无成熟产品问世 17 四 基因诊断的临床应用 遗传疾病肿瘤感染性疾病 传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别 亲子鉴定 18 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 19 实时荧光定量PCR技术 RealtimeQuantitativePCR 实时监测荧光起始模板 RealTimevs TraditionalPCRPCR 20 21 PCR分四个阶段 22 CtvalueBaselineThreshold 23 24 荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理 25 非理想的PCR反应 Xn X0 1 En n Xn 第n次循环后扩增产物数量 X0 起始模板数量 n 扩增循环数 荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理 26 在扩增产物达到荧光阈值时 XCt X0 1 En Ct M 1 XCt 荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量 在阈值设定以后 它是一个常数 定为M 方程式 1 两边同取对数得 Log2M Log2X0 1 En Ct 2 整理方程式 2 Log2X0 Log2M CtLog2 1 En 荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理 27 28 SYBRGreenI TaqManProbe MolecularBeacon TaqMan 29 SYBRGreenI 30 31 Dissociationcurve 32 33 PrimerLength 15 30bpPCRProduct 100 200bpG C 40 60 Tmofprimers 55 60 Tmofprobes 65 10 NoGat5 34 探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响 35 36 MethodsofQuantification 37 Abs