菌种传代与保藏作业指导书

菌种传代与保藏作业指导书菌种传代与保藏作业指导书 1 标准菌的来源 标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种 0 代 提供菌种证书 2 标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌 接收同 时应检查是否有随菌种附有的相关资料 接收菌种时应检查安瓿的 数量和名称 和每一支安瓿的完整性 在相应的菌种接收记录上记 上所有的关于菌种的信息 如名称 数量和接收日期等 在菌种安 瓿及菌种管上粘贴标签 内容包括 菌种名称 菌种代号 代次 接收日期 接收人 贮存条件 有效期至 新购入的 0 代原始菌种 储存于 20 有效期为三年 购买的已接种好的菌种斜面 3 代 应检查菌种管是否完好 储存于 2 8 有效期为 3 个月 3 标准菌的复苏 复壮及标准储备菌株的制备 3 1 物品及试剂 接种针 酒精灯 移液管 75 酒精及 75 酒精棉 球 3 2 培养基 改良马丁琼脂培养基 用于霉菌复苏 复壮 营养肉汤培养基 用于金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌 短小芽孢杆菌 铜绿假单胞菌复苏 复壮 3 3 操作步骤 a 打开洁净工作台 b 在安瓿的外表面用 75 的酒精擦拭并让其自然风干 c 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线 用手轻轻将安瓿掰开 开启 安瓿时必须小心 因为安瓿遇热时可能会破裂 d 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0 5 0 8 ml 到安瓿中 e 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解 f 用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基 g 根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度 细 菌培养温度 30 35 培养 18 24 小时 真菌培养温度 23 28 培养 3 5 天 观察是否浑浊 浑浊说明菌种复苏生长 若不浑浊 细菌应延长培养时间至 7 天 真菌应延长培养时间至 14 天 若仍未 浑浊 灭菌处理 h 取经复苏后的上述细菌菌液 8 10ml 至液体培养基中按 g 项操作对 菌种进行复壮 以无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20 的无菌 甘油混匀 1 2ml 管分装于冻存管 每个菌种制备 10 支 按顺序进 行编号 最后一支做为质控管进行质量控制 即进行相应的确认 其余作为储备管 黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h 项下方法进行复壮 制成复壮后的孢子悬液 20ml 以无菌技术向复壮后的菌种中加入 20ml 30 的无菌甘油混匀 1 2ml 管封存于冻存管 制备 10 支 按顺序进行编号 最后一支做为质控管进行质量控制 即进行相应 的确认 其余作为储备管 将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签 内容包括 菌种名称 菌种代号 编号 代次 制备日期 制备人 贮存条件 有效期至等 i 储备菌种管制备成功 储存于 20 有效期为三年 3 4 菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板 上 或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上 划线分离出单个菌落 然后在 30 35 下培养 2 3 天 同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼 脂培养基平板 并在 23 28 下培养 7 天 培养后 观察其菌落形 态 应符合该菌种形态特征 3 5 污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生长 则说明或操作有污染或菌种 不纯 将此被污染了的培养物灭菌处理 可寻找原因重新分离挑选 纯菌落转接斜面菌种作为第四代 并重新制备储备菌种管 3 6 菌种的传代与保藏 将菌种接种至一新鲜培养基上 每萌发一次即称为一代 因此 当原始菌种复溶并转至新培养基内生长 即认为已传代一次 从菌 种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第 0 代 冷冻干燥的原始菌种 开启后转种后为第 1 代 直到第 3 代为工作菌种 菌种的传代次数 自原始菌种冻干粉起 不得超过 5 代 菌种的传代保藏过程 3 3 项下标准菌的复苏为传第一代 复壮 为第二代 传第三代时取 1 支冻存管自然解冻 将其转接斜面菌种 作为工作用菌种 此时 工作用菌种为第 3 代 工作用菌种 分为 两类 一类用于定期传代 W3 一类用于实验用 S3 定期传代用菌的传代其操作步骤如下 斜面接种法 1 从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后 应在室温放置约 30 分钟 2 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日 期 和传代菌种一并移入洁净工作台 打开紫外灯照射一小时 3 关闭紫外灯 点燃酒精灯 左手握住菌种斜面 将管口靠近火 焰上方 右手拿接种棒后端 将接种环烧红约 30 秒 随后将接种棒 金属部分在火焰上烧灼 往返通过三次 4 右手用无名指 小指及掌部夹住管塞 左手将管口在火焰上旋 转烧灼 右手再轻轻拔开管塞 将接种环伸入管内先在近壁的琼脂 斜面上靠一下 稍冷后再至菌苔上 刮取少量菌苔 随即取出接种 棒并将菌种管口移至火焰上方 5 塞上管塞 左手将菌种管放下 取营养琼脂斜面 或改良马丁 琼脂斜面 一支 照上述操作打开管塞 将接种环伸入管内至琼脂 斜面的底部向上划一条直线 然后从底部向上作连续曲线划线 一 直划到斜面顶端 使细菌接种在斜面的表面上 6 取出接种环 在火焰上方将培养基管盖上塞子 然后将接种过 细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌 7 将已接种好的细菌管置 30 35 细菌培养箱培养 22 24h 真菌管置 23 28 真菌培养箱最多培养 7 天 当工作用菌种传代代数小于 5 时 可直接用上一代工作用菌种转接 下一代工作用菌种 如 W3 可直接转接为 W4 按上述程序操 作 直至 W4 转为 W5 为止 需重新接种 旧的工作菌种进行 销毁 菌种斜面的培养 保藏条件及时间 供参考 如相关菌种证书上有 特殊要求 以证书为准 序 号 菌种 培养条件 及时间 培养基 保存条件及 时间 1 大肠埃希菌30 35 营养琼脂2 8 注 菌种斜面 1 次 周观察状态是否正常 3 7 菌种的使用及销毁 22 24h培养基保存 3 个月 2 金黄色葡萄球菌30 35 22 24h 营养琼脂 培养基 2 8 保存 3 个月 3 枯草芽孢杆菌30 35 22 24h 营养琼脂 培养基 2 8 保存 3 个月 4 铜绿假单胞菌30 35 22 24h 营养琼脂 培养基 2 8 保存 3 个月 5 伤寒沙门菌30 35 22 24h 营养琼脂 培养基 2 8 保存 3 个月 6 霉菌23 28 最多 7 天 改良马丁 琼脂培养 基 2 8 保存 3 个月 每次进行菌种复活时 只能复活一个菌种 如果要复活其他菌时 应对所用物品重新消毒灭菌 每次