医学动物实验课题设计

医学动物实验课题的设计及实验动物的选择和应用,The design principles of animal experiments subject and selection and application of laboratory animals,一、医学动物实验课题 设计的基本原则,the design principles of animal experiments subject,（一）医学科学研究设计的基本原则(basic principles ),需要性原则目的性原则 可归纳为：创新性原则 创新性和先进性先进性原则 科学性和重复性科学性原则 有用性和可控性可行性原则 经济易行性效能性原则,（二）医学科研工作基本程序(basic procedure ),即所谓的科研三步曲: 1. 提出假说、确定题目战略性决定 2. 安排实验、验证假说战术组织 3. 总结工作、完成论文拿出战果,1. 提出假说、确定题目 初始意念或提出问题 查阅文献、调查访问 假说形成、提出设想 陈述问题、开题讨论 2. 安排实验、验证假说 实验设计 实验观察 数据资料积累 3. 总结工作、完成论文 数据资料处理 统计分析 提出结论,Where are you going?,（三）医学科学研究中对实验动物和动物实验的有关要求(requests),医学科研中应用的实验动物应当具备下 列完整资料： 品种、品系及亚系的确切名称 遗传背景及其来源 微生物检测状况 合格证书 饲育单位负责人签名,医学科研中根据不同的实验目的，选用相应的合格实验动物。申报科研课题和鉴定科研成果应当把应用合格实验动物作为基本条件。应用不合格实验动物取得的结果或者在安全评价结果无效,所生产的制品不得使用。,撰写医学论文时，有关实验动物和动物实验方面的描述内容主要应包括下述5项： 实验动物品种、品系名称 应准确写出，避免俗称。如Wistar大鼠，SD大鼠，KM小鼠等，不能写大白鼠小白鼠., 来源、遗传学背景及微生物学质量 写明哪类、哪级，合格证号码和颁发单位。 规范书写近交系动物名称 如BALB/c不能写成balb/c ，C57BL/6J 不能写成C57BL/6J等。 动物实验条件 如饲养方式、实验环境、饲养环境的级别 动物实验的处理方式 如麻醉剂的种类、剂量与方法，给药途径与方法，动物的处死方法等应尽可能的注明。,二、医学科学研究中选择实验动物的基本原则the selection principles and application of laboratory animals,临床研究和实验室研究是医学科学的两个基本途径，它们均离不开实验动物。尤其是实验室研究，实验动物是主要研究对象。 因此，选择什么样的实验动物作实验是医学科学研究工作中一个重要环节，不能随便选用一种实验动物来作科学研究，因为在不适当的动物身上进行实验，常可导致实验结果的不可靠，甚至使整个实验徒劳无功，直接关系到科学研究的成败和质量。 选择实验动物时一般应遵循下面几个原则：,（一）相似性原则(similarity),相似性原则是指利用动物与人类某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物。 医学研究的根本目的是要探索人类疾病发病机制，寻找预防及治疗方法。因此，动物的物种进化程度在选择实验动物时应该是优先考虑的问题。在可能的条件内，应尽量选择在结构、功能、代谢方面与人类相近的动物做试验。,一般来说，实验动物愈高等，进化愈高，其功能、代谢、结构愈复杂，反应愈接近人类，在实际应用中主要应考虑实验目的相一致。但不能因此就认为进化程度越高等的动物其所有器官、功能越接近于人。,可从以下方面将不同实验动物与人类进行比较，充分了解其间相似性和不同点。 1. 组织结构方面 如猪的皮肤组织结构与人类的相似，其上皮再生、皮下脂肪层、烧伤后的内分泌及代谢等也类似人类，故选用小型猪作烧伤实验研究较为理想。,2. 系统机能方面 许多动物各系统的功能与人类相似： 犬具有发达的血液循环和神经系统，在毒理方面的反应和人类也比较接近，适于作实验外科学、营养学、药理学、毒理学、行为学等方面的研究。,两栖类的蛙和蟾蜍，大脑很不发达，当然不能用于高级神经活动的研究，但在做简单的反射弧实验时，则很合适，因为最简单的反射中枢位于脊髓，而两栖类的脊髓已发展到合乎实验要求的程度，且其结构简单明了，易于分析。,3. 生理特性方面 许多哺乳类动物与人类一样，其心率、呼吸频率、体温三者成正比关系。发热时，心率和呼吸频率都增加。 但是，两栖类、爬行类是变温动物。因而选择两栖类或爬行类做体温调节方面的实验不合适。,鸟类的体温比哺乳类的高。恒温动物的体温昼夜有一定变动范围，变动情况与行为类型有关，一般夜间活动的动物凌晨2-3时是一日的峰值。 了解这些与人类的细微差别，对具体研究是十分有益的。动物的生理指标随其种类、年龄及周围环境变化而有差异，故其正常值变动范围较大，实验时应按照实际情况作具体考虑。,4. 生殖特性方面 哺乳类动物与人类一样，性成熟、妊娠期和寿命一般是成比例的。寿命越长，妊娠期越长，性成熟越晚。 许多实验动物有一定的繁殖季节，但有的在人工饲养条件下已发生改变。单胎动物比多胎动物产仔数少，多胎动物中近交系产仔数比封闭群少。这些都是在选择动物时要予以注意的。,5. 体液成分方面 动物血液性状与人类类似，体内的排出物有粪便、汗和尿液。鸟类粪便和尿液汇合于泄殖腔一同排出体外，而哺乳类有各自排泄孔道。 一般来说，淡水中生活的动物尿液是低渗的，海水中生活的动物尿液是等渗的，陆地上生活的动物尿液是高渗的，特别是沙漠中生活的动物，这种倾向性更明显。,水分供给少的动物尿液以尿酸为主要成分，水分供给充足的动物尿液以尿素为主要成分，而水中生活的动物尿液则以氨为主。 尿液的酸碱度因动物食性不同而有差异。草食类动物尿液呈碱性、粘度高，而肉食类动物尿液呈酸性，且有特殊的臭味。,6. 解剖特性方面 1）骨骼构成 不同种类动物间椎骨有很大差异。哺乳类动物椎骨以胸椎和尾椎较大。尽管哺乳动物和人类颈部外观有长短之差,但颈椎都是7个。齿式与食性密切相关，草食类和肉食类差异最为显著。杂食类动物，如猪与人的齿式十分一致。,2）脏器构成 灵长类神经系统发达，脑重量大。各种动物之间以及与人之间消化系统的器官重量差异不大，而呼吸、循环器官重量差异较大，运动量越大的动物越重。鸟类飞的越高，肺越重。肠道长度与食性有关。草食类比肉食类肠道长得多，特别是盲肠。无菌动物盲肠较大，与肠内无菌有关。,3）脏器形态 消化道大小、形状、构造因动物种类不同而差异显著。有单胃、复胃（反刍动物）之别。啮齿类动物肝的构成最为复杂。马和大鼠无胆囊。哺乳类和鸟类之间肺的形态差异显著。越是低等动物脑嗅球所占比例越大，一般来说，睡眠方式与行为类型有关，穴居生活的动物深睡眠期较长。不同进化等级动物的心脏形态差异较大，犬的心脏与人最为类似。,7. 疾病特点方面 实验动物有许多自发或诱发性疾病，能局部或全部地反映与人类类似疾病过程与特点，可用于研究相关的人类疾病。 如SHR大鼠、猫在弓形虫病,白化病,关节炎,骨质疏松症等方面的研究较为理想。 非人灵长类实验动物，可感染其他动物不可复制的人类传染病，如脊髓灰质炎、脑炎、肝炎、麻疹、痢疾、疟疾等。因此，可作为研究这些疾病发生、发展过程及疫苗研制的理想动物。,（二）标准化原则(standardization),标准化原则是指动物实验中选择和使用与研究内容相匹配的标准化的实验动物。为了保证生物医学研究实验结果的准确性和重复性，使用标准化实验动物是极其重要的。 只有选用经遗传学、微生物学、环境及营养控制的标准化实验动物，才能排除微生物及潜在疾病对实验结果的影响，排除因遗传污染而造成的个体差异。才能便于把我们所获得的实验研究成果在国际间进行学术交流。,选择何种遗传群动物，应根据不同的课题内容而定。 近交系动物由于遗传纯合度高，个体差异小，特征稳定，对实验反应一致性好，实验结果精确可靠而越来越广泛应用于医学生物学各个领域。 以群体为对象的研究课题，如人类遗传研究、药物筛选和毒性试验中，封闭群动物则更为合适。,选择何种微生物等级的实验动物，也应根据各级动物的特点，结合课题研究的水平、内容及目的而定。 一般而言，普通动物的实验结果的反应性差，故主要用于示教或方法探索的预试验。清洁动物是目前国内科研工作主要要求的标准实验动物，适用于大多数科研实验。,SPF动物是理想的健康动物，用它来研究，可排除疾病或病原的干扰，适用于所有科研实验、生物制品生产及检定，是国际公认的标准实验动物。涉及具有国际交流意义的重大课题，最好选用SPF动物。 无菌动物是一种非常规动物，仅适用于特殊研究之目的 。,此外，还应考虑所选用的动物类别或级别要与实验条件、实验技术、方法及试剂等相匹配。 既要避免用高精密度仪器、先进的技术方法、高纯度的试剂与低品质、非标准化、反应性能低的动物相匹配，又要防止用低性能的测试方法、非标准化的实验设施与高级别、高反应性能的动物相匹配，造成不必要的资源的浪费。,实验动物质量合格证犹如产品质量合格证一样，是标准化实验动物的标志。 所用动物的质量合格证明在论文、成果鉴定等时，是一个重要的证明材料，国家有关部门及国内外一些杂志编辑部将之作为论文是否发表、成果是否承认的基本条件之一。 一些部门已明确规定，缺乏所用动物的动物质量合格证明或科技成果检查新报告，均不能上报成果奖，一些论文在投稿时也因之被编辑部退回,而且此项规定正在全面推开。,（三）特殊性原则(particularity),1. 选用解剖生理特点符合实验目的要求的实 验动物做实验 这是保证实验成功的关键问题。 很多实验动物具有某些解剖生理特点，为实验所要观察的器官或组织等提供了很多便利条件，如能适当使用，将减少实验准备方面的麻烦，降低操作的难度，使实验容易成功。,不同种系实验动物对同一因素的反应往往是相似的，即有它共同性的一面，但也往往会出现特殊反应的情况，有它的特殊性。因此不同实验动物存在的这些特殊反应性在选择实验动物时更为重要。例如：,家犬红绿色盲，汗腺不发达，嗅觉特别灵敏。不能以红绿作为条件刺激物来进行条件反射实验。不宜选作发汗实验。家犬胃小、胰腺小，便于进行胃肠道生理的研究并适宜作胰腺摘除手术。 家兔颈部的交感神经、迷走神经和主动脉减压神经是分别存在，独立行走的，如要观察减压神经对心脏等作用时，就必须选用家兔。 乌贼的巨大神经纤维是研究膜电位、动作电位的理想材料。,家兔对体温变化十分灵敏，适于发热、解热和检查致热原等实验研究。小鼠和大鼠体温调节不稳定，就不宜选用。 鸽子、家犬、猴和猫呕吐反应敏感，适作呕吐实验，家免、豚鼠等草食动物呕吐反应不敏感，小鼠和大鼠无呕吐反应，不宜选用。 大鼠垂体-肾上腺系统发达，应激反应灵敏，适于做应激反应和内分泌实验研究。 豚鼠易于致敏，适于做过敏性实验研究。豚鼠体内不能合成维生素C，适合于坏血病及维生素C的实验研究。,2. 选择最敏感的实验动物做实验 各种实验动物在基因型、组织型、代谢型、易感性等方面的差异较大。 因此，医学科学研究中选用的动物除了要注意上述的特殊反应外， 还应选择对实验目的要 求最敏感 的实验动物作 实验。例如：, 过敏反应或变态反应宜选用豚鼠 以呕吐为指标的研究选用犬、猫为宜 机体致热反应、热原检测应选家兔 诱发性高血压病理模型选用犬、大鼠、兔 研究物质的致癌作用，常选用大、小鼠 研究气体、蒸气对粘膜的刺激作用选猫 研究毒物对皮肤局部作用选用豚鼠和兔 研究实质性脏器病时宜选用小鼠, 复制动脉粥样硬化常用兔,鸡,鸽,猴 研究放射性病时常选用犬,猴,大、小鼠 烧伤、烫伤研究中最好选用小型猪 进行血凝作用实验时最好选用鸡 制备各种免疫血清最好选用新西兰兔 研究糖尿病时常选用中国地鼠 复制脑梗死模型常选用蒙古沙鼠 研究人类弓形体病常选用猫,（四）规格化原则(normalization),规格化原则是指选择与实验要求一致的动物规格。由于不同动物对外界刺激的反应存在着个体差异，选择时，除了注意动物的种类及品系外，还应考虑到动物的年龄、体重、性别、生理及健康状况等，符合规格，这也是保证实验结果可靠性和可重复性的一个重要环节。 此外，动物的健康与否，直接影响到动物对各种外界刺激的反应性及耐受性，故选择健康动物用于实验研究是十分重要的。,1. 年龄 年龄是一个重要的生物量，动物的解剖生理特征和对实验的反应性随年龄的不同而有明显变化。 一般而言，幼龄动物较成年动物敏感，而老龄动物的代谢、各系统功能较为低下，反应不灵敏。因此，一般动物实验应选用成年动物。但不同实验对年龄要求不尽相同，需根据课题的内容而定。 由于不同种类实验动物的生活周期差别很大，动物实验时还要注意“天文学时间”和“生物学时间”的区别。其意义不同。,值得注意的是，不同种属实验动物的寿命与人类具有很大差异。在发育上，有的以日月计龄，有的以年计龄。例如： 人与犬的年龄对应值 犬 1y 2y 5y 8y 10y 12y 14y 16y 人 15 24 36 48 56 64 72 80 所以，选择动物时，应注意到各种实验动物之间、实验动物与人类之间的年龄对应。只有了解动物与人类之间的年龄对应关系，才能更好地进行实验设计、分析和总结。,2. 体重 实验动物年龄与体重一般正相关，可按体重推算年龄。例如KM小鼠6周龄时约32g，28g；Wistar大鼠则约为180g， 160g。此外，不同品种(系)、营养及饲养管理均影响体重。故选择时，要考虑体重是否符合要求，发育是否正常。 同批实验的动物年龄和体重应尽可能一致或相近，其差别不应超过10%。,实验动物 成年体重 未成年体重 （用于慢性实验）,小鼠 18-22 g 15-18 g大鼠 180-220g 80-100g豚鼠 350-650g 150-200g兔 2 - 3 kg 1.5-1.8 kg猫 1.5-2.5kg 1.0-1.5 kg犬 6-15 kg 1.5-1.8 kg,常用实验动物体重比较,3. 性别 不同性别动物对同一药物的敏感性差异很大，对外界刺激反应也各不相同。同一品系动物也是如此。例如氯仿、乙醇对小鼠肾脏造成的损害，只在雄性动物中表现明显，雌性小鼠则无损害或损害较小。 一般而言，实验若对动物性别无特殊要求，则宜选用雌雄各半。,（五）经济性原则(economical efficiency),经济性原则是指尽量选用容易获得、价格便宜和饲养经济的动物。 实际工作中，选择实验动物还必须考虑课题经费有限性这一因素。在不影响整个实验质量的前提下，尽量做到方法简便和降低成本。这就涉及到选用易获得,最经济和最易饲养管理的实验动物。,例如，非人灵长类动物（猴等 ）诱发动脉粥样硬化时，病变部位经常在小动脉，即使出现在动脉也与人类分布不同。据报道用鸽做这类模型时，胸主动脉出现的黄斑面积可达10，镜下变化与人也较相似。因此也广泛被研究者使用。,又如果蝇具有生活史短(12天左右)、饲养 简便、染色体数少(只有4对)、唾腺染色体制作容易等诸多优点，所以是遗传学研究的绝好材料，而同样方法若以灵长目动物为实验材料，其难度是可以想象的。,因此，科学研究中，在不影响实验的前提下，选用易获得、最经济、最易饲养管理的动物（可参照文献或本专业实际经验）。 最理想的设计目标是用较少的人力、动物和时间，以最小的代价最大限度地获得科学性强的实验结果。,果蝇：遗传学和分子发育生物学的国王图中左侧为雌性，右侧为雄性,（六）伦理学原则(ethical rule),动物实验对生物学、生物医学及行为科学的发展和未来都是至关重要的。动物实验不仅使人们对一些自然现象和特定的生命过程机制增加了解，还改进了人类和动物疾病预防/诊断/治疗方法。 动物与人一样，都是生命体，它们同样应当受到尊重和善待。动物实验探索中，动物是对人类的一种贡献，而不是赋予实验者的一种使用权力，对这种贡献必须采取保护措施，遵循的一定的原则，并贯穿于整个研究过程中：,1.人道地使用动物 是指负责地、合乎道德地使用动物。使用动物开展科学研究时，都必须遵循这条根本原则，以确保研究结果具有科学性、重复性、可靠性。 2.符合“3R”原则 使用动物进行的任何科学研究，都必须符合替代 (Replacement), 减少 (Reduction),优化（Refinement）的原则，尽量使用替代方法。研究人员只有在用其他替代方法尝试失败后，才可使用动物进行实验。,3.饲养管理标准化 用于实验的动物必须采用标准的饲养管理，建筑设施、笼器具应舒适、安全，同时还要重视动物的社会行为需求。尽量减少由于设施、笼器具不合适和抓取不正确所造成的刺激，还应避免不必要的疼痛、痛苦和紧张刺激。 4.掌握必要的实验知识 如进行动物实验的人员培训、熟悉实验动物的生物学特性以及动物实验的操作方法等。,三、影响动物实验效果的 动物实验技术环节因素the influence factor on effect of animal experiments,（一）动物选择(animal election),选择好适合研究需要的实验动物是获得正确实验结果和实验成功的重要环节。应按照不同实验的要求选择合适的动物。 如做肿瘤的研究工作，就必须了解哪种动物是高癌种，哪种是低癌种，各种动物自发性肿瘤的发生率是多少。如A系、C3H系、AKR系、津白II等小鼠是高癌品系小鼠，C3HHe系经产雌鼠有80-100的自发性乳腺癌。AKR系8-9月龄小鼠有80-90自发性白血病。C57BL系、津白I等小鼠是低癌品系小鼠。,（二）实验季节(Experimental season),生物体的许多功能随着季节产生规律性的变动。目前已有大量资料表明，动物对化学物作用的反应也受到季节的影响。 例如在春、夏、秋、冬分别给10只大鼠注入一定量的巴比妥钠，发现入睡时间以春季最短，秋季最长，而睡眠时间则相反。,再如不同季节对辐射效应有影响。家兔、犬的放射敏感性在春、夏两季升高，秋、冬两季降低。小鼠的放射敏感性，在冬季和初夏显著升高，而初秋和夏季则降低。大鼠则没有明显的季节性波动。,（三）昼夜过程(Night and day),机体的有些功能还有昼夜规律性变动。例如有人给小鼠皮下重复注入40的四氯化碳溶液0.2m1后，在同一天不同时间将动物处死，小鼠肝细胞有丝分裂的昼夜变动十分明显。 实验证明实验动物的体温、血糖、基础代谢率、内分泌激素的分泌均发生昼夜节律性变化。因此，这类实验的观察必须没有相应的对照，并注意实验中某种处理的时间顺序对结果的影响。,（四）麻醉深度(Anesthetic Depth),动物实验中往往需要将动物麻醉后才行各种手术和实验。麻醉深度要适度，而且在整个实验过程中要保持始终恒定。 因此，不能不分别实验要求和动物品种(或品系)而用同一种麻醉剂，也不能乱用麻醉剂。应根据实验要求与动物种类而加以选择。 麻醉过深，动物各种正常反应受至抑制，不可能做出可靠的实验结果。麻醉过浅，实验时则会刺激动物，影响呼吸、循环、消化功能。,（五）手术技巧(Surgical techniques),动物实验中除了要注意选择合适的实验动物，试剂纯，仪器灵，方法准外，还必须注意手术技巧，即操作技术熟练。手术熟练可以减少对动物的刺激，将会提高实验成功率和实验结果的正确性。 所以，必须了解各种动物的特征，组织、器官的位置，神经、血管的走行特点，通过在动物身上反复实践，即可达到熟能生巧、操作自如。,（六）实验药物(experimental dr