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猪肠道健康的营养调控 谯仕彦qiaoshy 饲料营养价值评价与营养需要猪肠道健康的营养调控母猪营养饲料加工工艺营养与肉品质IUGR猪的发生机制及其营养调控饲料安全与有效性评价发酵饲料研究开发生物饲料添加剂 酶制剂 微生物制剂 抗菌肽 研究开发 农业部饲料工业中心的研究领域 农业部饲料工业中心国家饲料工程技术研究中心农业部饲料效价与安全监督检验测试中心 北京 生物饲料添加剂北京市重点实验室饲用抗菌肽北京市重点实验室 农业部饲料工业中心的研究平台 功能性氨基酸的营养生理功能生长肥育猪低氮排放日粮技术体系研究益生菌及微生物制剂抗菌肽 主要内容 一 功能性氨基酸的营养生理功能 1 精氨酸与NCG 初产母猪 n 53 妊娠第30 114天添加1 L 精氨酸盐酸盐对繁殖性能影响 Mateoetal 2006 J Anim Sci 84 Suppl 2 7 8 精氨酸提高大鼠繁殖性能 Zeng等 2008 J Nutr 精氨酸通过PI3K PKB mTOR NO信号途径提高大鼠早期胚胎着床 Zeng等 2013 Reproduction Zeng等 2013 Reproduction 猪小肠中精氨酸的内源合成途径 N 乙酰谷氨酸 NAG 是精氨酸内源合成的限速酶 氨基甲酰磷酸合成酶 1 CPS 1 的变构催化剂 是精氨酸合成途径的必需辅助因子 Wu和Morris 1998 NCG与NAG 2005年开始研究合成工艺 2008年5月实验室成功合成纯度达到97 的NCG产品 并于同年申请专利2008年10月委托农业部兽药安全监督检验测试中心开展安全评价试验2009年8月完成中试工艺 2010年6月稳定生产工艺2010年8月委托四川农业大学动物营养研究所开展有效性性评价试验2011年年底向农业部全国饲料评审委员会申请新饲料添加剂 2012年2月全国饲料评审委员会组织了会议评审2012 2013 补试验2014年4月 获农业部新饲料添加剂证书 国家饲料工程技术研究中心对NCG的研发历程 吴德等 2013 日粮添加不同水平NCG对妊娠母猪体血浆尿素氮和血氨浓度的影响 吴德等 2013 日粮添加不同水平NCG对妊娠母猪体血液NO浓度的影响 吴德等 2013 饲粮添加不同水平NCG对妊娠母猪血浆中血管生成相关因子的影响 吴德等 2013 饲粮添加不同水平NCG对妊娠母猪胎盘绒毛膜组织中血管生成相关基因表达的影响 饲粮添加不同水平NCG对妊娠母猪胎盘绒毛膜组织FGF 2 eNOS VEGFA ANG 1 ANG 2和PlGFmRNA表达量的影响 数值采用means SEM表示 n 8 以 表示P 0 05 表示P 0 01 注 eNOS 内皮型一氧化氮合酶 VEGFA 血管内皮生长因子 FGF 2 碱性成纤维细胞生长因子 PlGF 胎盘生长因子 ANG 1 血管生长因子1 ANG 2 血管生长因子1 吴德等 2013 母猪饲粮添加不同水平NCG对新生仔猪血浆游离氨基酸浓度的影响 注 同行数据标注不同小写字母表示差异显著 P 0 05 相同字母或无字母表示差异不显著 P 0 05 NCG通过P13K PKB mTOR信号途径提高大鼠妊娠早期胚胎着床 Zeng等 2012 PlosOne 教槽料中添加NCG对新生和断奶后仔猪生长性能的影响 黄志敏 2012 中国农业大学硕士学位论文呢 代乳粉中添加NCG对新生仔猪第14d血浆精氨酸家族氨基酸浓度的影响 黄志敏 2012 中国农业大学硕士学位论文呢 Zhang等 2013 PlosOne Zhang等 2013 PlosOne Zhang等 2013 PlosOne 瓜氨酸 精氨酸 NCG NO eNOS PI3K Akt mTOR 谷氨酸 脯氨酸 鸟氨酸 多胺 胎盘绒毛膜FGF 2 eNOS NEGFA ANG 1 ANG 2 PIGF等相关基因表达 胎盘和胎儿血管发育 母体向胎儿输送养分和氧气 胎儿生长与发育 提高母猪繁殖性能的作用机制 2 苏氨酸 苏氨酸在肠道的去向 采食的苏氨酸 肠道 60 85 蛋白质合成 氧化供能 97 3 黏液蛋白 内源分泌 CO2 IgA 黏膜蛋白 日粮真可消化苏氨酸对7 13kg猪生长性能的影响 WangXu QiaoShiyan etal 2006 Anim FeedSci Technol 日粮真可消化苏氨酸对7 13kg猪蛋白质合成效率的影响 XuWang ShiyanQiao 2007 J nutr 日粮TID苏氨酸水平对大肠杆菌激发前后断奶仔猪空肠黏膜IgG含量的影响 IgG 苏氨酸水平P 0 05E coliP 0 06互作P 0 07 IgG浓度 日粮TID苏氨酸水平 g kg g g Wangetal J Nutr 2007 日粮TIDThr与仔猪肠绒毛发育和粘上皮细胞凋亡 WeiweiWang ShiyanQiao etal 2009 J Nutr 日粮TIDThr与仔猪肠粘液蛋白质合成量 断奶仔猪肠粘膜完整性对日粮TIDThr的需要量为0 89 此时TIDThr TIDLys为74 8 是NRC 1998 推荐量的120 WeiweiWang ShiyanQiao etal 2009 J Nutr 日粮真可消化苏氨酸对仔猪小肠黏液蛋白基因表达的影响 WeiweiWang ShiyanQiao etal 2009 J Nutr 0 10 20 30 40 50 60 70 80 5 10kg 10 20kg 20 50kg 50 120kg Lactationsow TIDThr TIDLys 65 Mao X B X F Zeng S Y Qiao D F Li FrontiersinBioscience 3 亮氨酸 Mao等 2011 MolBiolRep 亮氨酸通过mTOR通路提高大鼠C2C12肌管Leptin表达 Mao等 2012 BritJNutr Mao等 2012 BritJNutr 亮氨酸和Leptin协同调节C2C12肌管和大鼠骨骼肌蛋白质代谢 低蛋白日粮添加亮氨酸对成年大鼠骨骼肌中4E BP1磷酸化的影响 mTOR 4EBP1 eIF4E eIF4G eIF4E 4EBP1 P mRNA Leucine P 图6低蛋白日粮添加亮氨酸对成年大鼠骨骼肌中S6K1磷酸化的影响 mTOR mRNA Leucine P 亮氨酸主要是通过提高mTOR通路中S6K1磷酸化程度来提高成年大鼠骨骼肌蛋白质合成 低蛋白日粮添加亮氨酸对成年育肥猪氮平衡的影响 低蛋白日粮添加亮氨酸对成年育肥猪全身蛋白质周转的影响 图7低蛋白日粮添加亮氨酸对成年育肥猪全身蛋白质周转的影响 低蛋白日粮添加亮氨酸对成年育肥猪胴体性状的影响 低蛋白日粮添加亮氨酸对成年育肥猪肉品质和肌肉发育的影响 14 5 CP10 CP Ala10 CP Leu 14 5 CP10 CP Ala10 CP Leu 背最长肌纤维染色图 半膜肌纤维染色图 4 支链氨基酸 日粮蛋白质水平 生长性能 YueandQiao LivestockScience 2008 日粮蛋白水平对6 15kg仔猪肠绒毛发育的影响 um Y L YaoandS Y Qiao LivestockScience 2008 低蛋白质日粮与氨基酸平衡 YueandQiao 2009 JAnimSci YueandQiao 2009 JAnimSci 断奶仔猪低蛋白质日粮补充BCAA 日粮设计 Zhang等 2013 AminoAcids Zhang等 2013 AminoAcids Zhang等 2013 AminoAcids Zhang等 2013 AminoAcids Zhang等 2013 AminoAcids 二 生长肥育猪低蛋白质日粮技术体系研究 体蛋白沉积的AA 未消化的蛋白的AA 用于基础代谢的AA 不平衡浪费的AA 过量蛋白质浪费的AA 猪食入蛋白质 氨基酸 的分配 50kg体重 16 CP日粮 内源损失的AA 皮肤和毛发损失AA的 低蛋白质日粮的环保意义 Relendeau等 2000 在玉米 豆粕型日粮中 以净能配制日粮 日粮蛋白比 猪饲养标准 2004 推荐值降低4个百分点后 补充合成氨基酸后 生长肥育猪猪采食低蛋白日粮可获得与高蛋白相似的生产性能和胴体品质 生长猪低蛋白玉米 豆粕型日粮中 获得最大平均日增重和最佳饲料转化率的净能需要量为2 36Mcal kg 相应的赖氨酸净能比为4 70g Mcal 在育肥猪低蛋白日粮中 获得最佳生产性能的净能需要量为2 36Mcal kg 获得最佳胴体品质的净能需要量为2 40Mcal kg 相应的赖氨酸净能比为3 50g Mcal 1 生长猪低蛋白质日粮NE与NE Lys的研究结果 Yi等 2009 SwineProdutionHealth 2010 ChinaAgriSci 将20 50kg生长猪日粮蛋白质水平从19 降至15 在日粮NE为2 35 2 40Mcal kg时 其回肠标准可消化赖氨酸的需要量为1 03 此时 日粮中标准回肠可消化含硫氨基酸 苏氨酸 色氨酸与标准回肠可消化赖氨酸比分别为0 61 0 66 0 21 2 生长猪低蛋白质日粮的限制性氨基酸模式研究结果 Zhang等 2012 LivestockSci 2013 AnimFeedSciTechnol 2013 AchAnimNutr 猪氨基酸需要量的研究方法 先求限制猪生长的日粮赖氨酸水平 Zhang等 LivestockSci 2012 用ADG表达的生长猪低蛋白质日粮中色氨酸与赖氨酸之比 Zhang等 LivestockSci 2012 用饲料 增重表达的生长猪低蛋白质日粮中色氨酸与赖氨酸之比 Zhang等 LivestockSci 2012 用血浆尿素氮浓度表达的生长猪低蛋白质日粮中色氨酸与赖氨酸之比 Zhang等 LivestockSci 2012 生长猪低蛋白质日粮的限制性氨基酸模式验证 试验动物 22 85 1 32kg的杜 长 大三元生长猪12头 6X6双拉丁方设计 分为对照组和低氮日粮组 每个处理6个重复 每个重复2头猪 试验日粮 NE 2 40Mcal kg 对照组 CP 18 3 SID赖氨酸1 03 试验组 CP 14 5 SID赖氨酸1 03 对照组标准回肠可消化含硫氨基酸 苏氨酸 色氨酸与赖氨酸比例按照理想氨基酸模型设置 低氮组标准回肠可消化含硫氨基酸 苏氨酸 色氨酸与赖氨酸比例设置为0 61 0 66 0 21 生长猪低蛋白质日粮限制性氨基酸模式对生长猪生长性能的影响 生长猪低蛋白质日粮限制性氨基酸模式对生长猪胴体品质和肌肉品质的影响 生长猪低蛋白质日粮限制性氨基酸模式对生长猪肠道微生物菌群的影响 logCFU g 生长猪低蛋白质日粮限制性氨基酸模式对生长猪小肠绒毛形态的影响 60 100kg的肥育猪 将日粮蛋白质水平从14 降至11 在日粮净能水平在2 4时 获得最大增重的日粮标准回肠可消化赖氨酸需要量为0 7 此时日粮标准回肠可消化苏氨酸 含硫氨基酸 色氨酸与标准回肠可消化赖氨酸的比分别为 0 65 0 60和0 19 3 育肥猪低蛋白质日粮的限制性氨基酸模式研究结果 Xie等 2013 AnimFeedSciTechnol 2013 Asian AustJAnimSci 2 CAU猪低氮排放日粮的营养需要量推荐值 三 益生菌与肠道健康 73 引自 DANMAP 2002 中国3个猪场的抗生素使用情况 Yong GuanZhu等 PNAS 2012 110 9 3435 3440 Yong GuanZhu等 PNAS 2012 110 9 3435 3440 莆田嘉兴北京对照 莆田嘉兴北京莆田嘉兴北京对照 抗药性基因种类 氨基糖苷类内酰胺类喹诺酮 氨基糖苷类 氯霉素 内酰胺类多重抗药性大环内酯类 链霉素类 内酰胺类等多重耐药四环素类万古霉素其他 Yong GuanZhu等 PNAS 2012 110 9 3435 3440 在猪场粪便中的抗生素抗性基因的种类和数量远高于自然环境 而且抗生素抗性基因向环境中扩散的趋势 造成土壤的污染 L gasseri L acidophilus L reuteri L fermentum 四株乳酸杆菌在Caco 2细胞的黏附 LiandQiao J Appl Microboil 2008 104 1082 1091 四株乳酸杆菌对沙门氏菌的竞争性黏附 LiandQiao J Appl Microboil 2008 104 1082 1091 L acidophilus L gasseri L reuteri L fermentum 发酵乳酸杆菌I5007在肠道内糖苷水解酶的表达增加 Yang Qiao etal Electrophoresis 2007 28 4330 4339 体外培养糖苷水解酶的表达 肠道内孵育4小时糖苷水解酶的表达 发酵乳酸杆菌对断奶仔猪肠道黏液蛋白基因 MUC2 表达的影响 WangandQiao Anton Leeuw Int J Gene MolecularMicrobiol 图2发酵乳酸杆菌I5007对羟基自由基的清除能力 图1发酵乳酸杆菌I5007对过氧化氢的耐受能力 90 91 84 7 35 WangandQiao J Appl Microboil 2009 Liu等 2013 JAgriFoodChem 葡萄糖 果糖等单糖 EMP HMP等途径 彻底氧化分解提供能量 糖原 肠道微生物 氧化分解提供少量能量 CO2 H2O 后肠段 寡糖 增殖 糖异生 多糖 淀粉 糖原 消化酶 肠道微生物 葡萄糖 果糖等单糖 挥发性脂肪酸 降低肠道pH 纤维素 单糖等 肠道微生物与糖代谢的关系 Theobesemicrobiomehasanincreasedcapacitytoharvestenergyfromthediet 胖微生物 厚壁菌门 能提高宿主从日粮中获取能量的能力除酵母菌外 其他益生菌都属于厚壁菌门微生物 Turnbaugh etal Nature 2006 444 1027 1031 EGFR epidermalgrowthfactorreceptor ERK extracellular signal regulatedkinases lipoteichoicacid PI3K phosphoinositide3 kinase STAT transducerandactivatoroftranscription LipoteichoicacidandsurfacelayerproteinA NLRP NOD LRR andpyrindomain containing Bron等 2011 NatureReviewMicorobiology 微生物制剂 作为治疗药的应用前景 新生儿坏死性肠炎 neonetalnecrotizingenterocolitis 极低初生重 ELBW 婴儿急性肠炎与抗生素相关的腹泻 associated antibioticsdiarrhoeaAAD 湿疹 eczema 肥胖症 obesity 肠道易激综合症 irritablebowelsyndrome IBS 抗氨苄青霉素粪肠球菌与抗万古霉素粪肠球菌溃疡性结肠炎 ulcerativecolitis 益生菌存在的问题与对策 安全性有效性评价手段 体内外评价模型菌种的抗逆性 选育技术制剂的稳定性 后处理工艺作用机制 微生物制剂选育技术的发展 高通量筛选技术自然选育原生质体诱变技术原生质体融合育种技术基因工程育种技术产酶 氨基酸 酸产细菌素抗逆性能 酸 氧 温度 微生物制剂的开发 建立了较为完整的微生物选育 发酵 后处理工艺平台建设了近3000个菌株的菌种资源库 芽孢杆菌 乳酸菌 酵母建立了初步的微生物制剂安全性和有效性评价细胞模型和动物模型 四 抗菌肽 1 抗菌肽的定义 抗菌肽 是生物体内经诱导产生的具有生物学活性的小分子多肽 它们与机体先天性免疫功能密切相关的 由20 50个氨基酸残基 具有强碱性 热稳定性和广谱抗菌活性 在核糖体中合成经过蛋白质的著录和翻译微生物产生的具有抑制或杀灭其它微生物的代谢产物或次级代谢产物 92 抗菌肽是动物体免疫组成的实例 始作俑者 甲类链球菌 受害者 人类皮肤 92 正常对照组小鼠组织培养物内病菌极少 敲除基因但添加抗菌肽小鼠组织培养物内病菌数量较少 病菌受到抗菌肽抑制 敲除基因未添加抗菌肽小鼠组织培养物内病菌数量最多 短链脂肪酸可诱导动物体内抗菌肽的产生 Shortchainfattyacid EnergySource WoundHealing CellProliferation pH Mucous Sodium WaterAbsorption AMPProductionandImmuneRegulation 丁酸使空肠和结肠防御素产量增加 短链脂肪酸诱导猪小肠防御素的表达 Zengetal 2013 PloSOne 是CA与CD融合表达的产物 氨基酸序列 KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK分子量 3866 64Da Chenetal2009 AntimicrobAgentsChemothe 1 天蚕素抗菌肽的表达与结构 制得标准品 建立了HPLC检测方法和纯化中试工艺 建立了抗菌谱 2 天蚕素抗菌肽对细菌细胞的作用机制 Time killingcurvesofAMPonS aureusCVCC1882 a andATCC43300 b 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheappearanceofMRSAasseenbyscanningelectronmicroscopy 王庆伟 谯仕彦 2014 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheappearanceofMRSAasseenbytransmissionelectronmicroscopy 103 Effectsof0 125 MICAMPoncellsizeinMRSA 王庆伟 谯仕彦 2014 DifferentiallyexpressedproteinsofMRSAcellstreatedwith0 125 MICAMP right orwithoutAMP left 王庆伟 谯仕彦 2014 王庆伟 谯仕彦 2014 mRNAlevelsofdifferentiallyexpressedproteinsofMRSAcellsafter0 125 MICAMPtreatment 1 D lactatedehydrogenase 2 putativetranslaldolase 3 phosphoenolpyruvatecarboxykinase 4 1 Pyrroline 5 carboxylatedehydrogenase 5 NAD specificglutamatedehydrogenase 6 alaninedehydrogenase 7 alkylhydroperoxidereductasesubunitC 8 superoxidedismutase 9 chainA S aureusthioredoxin 3 抗菌肽对金葡菌CVCC1882感染小鼠的治疗作用 Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 EffectsofAMPontheclinicalfeaturesandmortalityinS aureusCVCC1882infectedmice Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 Histogramsdemonstratingtheheightofvilli a andintestinecellproliferation b inresponsibletoS aureuschallengeandAMPtreatment Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 PicturesofPCNA specificimmunostainingoftheintestines Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 WesternBlotforNF B P65 andiNOSinintestinalsamples EffectsofAMPonthecaspase 3positivecellsinS aureusinfectedmice a control b S aureus c 4 0mg kgSublancin d 2 0mg kgampicillin Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 EffectsofAMPonCD4positivecellsinS aureusinfectedmice a control b S aureus c 4 0mg kgSublancin d 2 0mg kgampicillin Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 EffectsofAMPonCD8positivecellsinS aureusinfectedmice a control b S aureus c 4 0mg kgSublancin d 2 0mg kgampicillin Q W Wangetal AnatomicRecord 2014 4 抗菌肽对金葡菌CVCC43300感染小鼠的治疗作用 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheclinicalfeaturesandmortalityinS aureusATCC43300infectedmice 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheclinicalfeaturesandmortalityinS aureusATCC43300infectedmice 王庆伟 谯仕彦 2014 Histogramsdemonstratingtheheightofvilli a andintestinecellproliferation b inresponsibletoS aureuschallengeandAMPtreatment 王庆伟 谯仕彦 2014 a WesternBlotforNF B P65 andiNOSinintestinalsamples 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPonthecaspase 3positivecellsinS aureusinfectedmice 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheCD4positivecellsinS aureusinfectedmice 王庆伟 谯仕彦 2014 EffectsofAMPontheCD8positivecellsinS aureusinfectedmice 5 抗菌肽对肉鸡坏死性肠炎的治疗作用 王帅 谯仕彦 2014 TheeffectofAMPandClostridiumperfringenschallengeonbroilerperformance 王帅 谯仕彦 2014 TheeffectofAMPandClostridiumperfringenschallengeonsmallintestinalmorphology 王庆伟 谯仕彦 2014 TheclinicalsignsandpathologicalchangesofClostridiumperfringens infectedbroilersandcontrolbroilers A Nogrosslesionwasdetectedintheintestineofcontrolbroilerseuthanizedond28oftrial B Depression bristlingfethersandwhitish yellowdiarrheawereobservedintheinfectedbirdat5dafterfirstC perfringensinoculation C Hyperemiaandhemorrhageofintestinalmucosa D needle likebleedingpointsinthegutwall E ballooningofintestineand F necroticlesionsintheliverwereobservedinthebirdsofinfectedcontrolgroupnecropsiedond28 图1 328日龄肉鸡肝脏外观变化A 对照 B 未治疗组 C 抗菌肽治疗 王帅 谯仕彦 2014 Intestinallesionscoresofdifferenttreatmentsgroupsond28oftrial GroupsthataresignificantlydifferentfromeachotheratP 0 05areindicatedbydifferentletters a b 王帅 谯仕彦 2014 Clostridiumperfringens Escherichiacoli Lactobacilluscountsinthecaecumofbroilerchickensond28oftrial GroupsthataresignificantlydifferentfromeachotheratP 0 05areindicatedbydifferentletters a c 王帅 谯仕彦 2014 TheeffectofsublancinandClostridiumperfringenschallengeonimmuneresponseofbroilerchickens A SerumimmunoglobulinG IgG B Interleukin 1 IL 1 C IL 6and D tumornecrosisfactorintheileumofbroilerchickens ErrorbarsindicateSD GroupsthataresignificantlydifferentfromeachotheratP 0 05areindicatedbydifferentletters a d 6 抗菌肽对大肠杆菌攻毒仔猪和肉鸡的作用 日粮中添加不同水平