毕业论文终稿-尚宝龙

分类号 分类号 密级 密级 研研 究究 生生 学学 位位 论论 文文 校址 甘肃省兰州市校址 甘肃省兰州市 论文题目 中文 论文题目 中文 川木香属 菊科 的川木香属 菊科 的 DNA 条形码研究条形码研究 论文题目 外文 论文题目 外文 DNA barcoding of the genus Dolomiaea Asteraceae 研究生姓名研究生姓名 尚宝龙尚宝龙 学科 专业学科 专业生物学生物学 生态学生态学 研究方向研究方向 分子生态学分子生态学 学位级别学位级别 硕硕 士士 导师姓名 职称导师姓名 职称 王玉金王玉金 教授教授 论文工作论文工作 起止年月起止年月 2012 年年 9 月至月至 2015 年年 5 月月 论文提交日期论文提交日期 2015 年年 5 月月 论文答辩日期论文答辩日期 2015 年年 5 月月 学位授予日期学位授予日期 原原 创创 性性 声声 明明 本人郑重声明 本人所呈交的学位论文 是在导师的指导下独立进行研究 所取得的成果 学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果 数据 观点 等 均已明确注明出处 除文中已经注明引用的内容外 不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究成果做出重要贡献的个人 和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名 日 期 关于学位论文使用授权的声明关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品 知识产权归属兰州大 学 本人完全了解兰州大学有关保存 使用学位论文的规定 同意学校保存或 向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文 本人离校后发表 使用学 位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时 第一署名单位仍然为兰州大 学 本学位论文研究内容 可以公开 不易公开 已在学位办公室办理保密申请 解密后适用本授权书 请在以上选项内选择其中一项打 论文作者签名 导师签名 日 期 日 期 I 川木香属 菊科 的川木香属 菊科 的 DNADNA 条形码研究条形码研究 中文摘要 川木香属是青藏高原及其邻近地区的一个特有属 该属多种植物具有非常 重要的药用价值 然而 川木香属植物种间分类和物种间的亲缘关系依然不明 确 使用运用传统的形态学方法很难实现这些植物的准确鉴定 DNA 条形码技 术 DNA barcoding 作为一种新型有效的分子生物学方法为川木香属物种的准 确和快速鉴定带来了新的曙光 在本研究中 我们采集到了川木香属 15 个物种 共计 122 个个体 我们通过邻接法 Neighbor joining NJ 贝叶斯 Bayesian inference BI 和 TaxonDNA 三种不同的分析方法对 5 套个叶绿体片段 matK M rbcL R trnH psbA H trnL F 和 psbK psbI P 1 套个核基因 ITS 片段以 及它们的组合数据在川木香属植物中的通用性和物种分辨率进行了研究 结果 表明 除叶绿体 matK 片段外 其它单片段在川木香属植物中均表现出高的引 物通用性 三种不同的分析方法中 TaxonDNA 方法得到的物种分辨率最高 另外两种分析方法 NJ BI 得到的物种分辨率相差不大 所有单片段条形码 中 核基因 ITS 片段显示出最多的变异位点 最大的种间变异及最高的物种分 辨率 73 30 73 43 其余 5 套叶绿体片段物种分辨率由高到低依次为 psbK psbI 53 30 64 06 matK 46 7 54 68 trnL F 40 0 59 37 trnH psbA 33 30 59 37 rbcL 28 12 33 30 在 27 套组 合数据中 生物条形码联盟 CBOL 2009 推荐的植物核心条形码 matK rbcL 片段显示出较高的物种分辨率 73 30 73 43 而叶绿体与核基因的组合 matK ITS 片段物种分辨率达到了最大值 80 0 90 62 这一结果等于所有单 片段组合 matK rbcL trnH psbA trnL F psbK psbI ITS 的物种分辨率 最终 基于 TaxonDNA 方法的 Best match 分析 表明叶绿体与核基因的组合 matK ITS 片段能够成功鉴定川木香属 15 个物种中的 13 个物种 90 62 我 们建议叶绿体与核基因的组合 matK ITS 片段可作为该属植物的条形码片段 可见 DNA 条形码技术为川木香属植物的物种鉴定提供了一种快速 可靠 有 效的分子鉴定手段 关键词 关键词 川木香属 DNA 条形码 分辨率 组合 II DNADNA barcodingbarcoding ofof thethe genusgenus DolomiaeaDolomiaea Asteraceae Asteraceae AbstractAbstract Dolomiaea Asteraceae is an endemic genus mainly distributed in the Qinghai Tibetan Plateau and adjacent regions and plays an important role in traditional herbal medicine in China However the interspecific classification and species relationships in this genus remain problematic which are difficult to discriminate by morphological characteristics of those plant DNA barcoding as a new and an effective method of molecular biology are expected to medicinal plants of Dolomiaea to bring a new dawn In the present study we used neighbor joining NJ Bayesian inference BI and TaxonDNA three different analytical methods to tested the universality and the discrimination power of five chloroplast markers matK M rbcL R trnH psbA H trnL F L and psbK psbI P one nuclear barcode marker ITS and their combinations among 122 samples representing 15 species of Dolomiaea The results showed that all these DNA markers except matK marker the other single markers exhibited high primer universality in Dolomiaea three different analytical methods show that the TaxonDNA method acquired the highest level of species discrimination rates and the other two methods NJ BI showed little difference of species discrimination rates Among all single barcode candidates the nuclear ITS marker showed the most variable sites larger interspecific variation and the highest rate of species discrimination 73 30 73 43 progressively lower for the other five chloroplast markers of species discrimination rates psbK psbI 53 30 64 06 matK 46 7 54 68 trnL F 40 0 59 37 trnH psbA 33 30 59 37 rbcL 28 12 33 30 Of the 27 combinations of markers matK rbcL as recommended by the Consortium for the Barcode of life CBOL 2009 showed relative higher rate of species discrimination 73 30 73 43 while the species identification rate of the combination matK ITS reached maximum value 80 0 90 62 almost equal to all single barcode combinations of the discrimination rates At last based on Best match analysis of the TaxonDNA the combination matK ITS of chloroplast and nuclear markers successfully identified 13 of 15 species of Dolomiaea 90 62 we suggested the combination matK ITS markers as the DNA barcodes of this genus In this case study DNA barcoding is a convenient technique and provides a reliable and effective mean for the discrimination of Dolomiaea species Keywords Dolomiaea DNA barcoding discrimination rates combination III 目录目录 中文摘要 I Abstract II 第一章 前言 1 1 1 DNA 条形码 DNA barcoding 1 1 1 1 DNA 条形码的概念及发展史 1 1 1 2 DNA 条形码的选择标准及优点 5 1 1 3 DNA 条形码的工作流程及分析方法 5 1 1 4 DNA 条形码存在的问题及发展前景 7 1 2 川木香属概述及本次研究的目的 8 1 2 1 川木香属概述 8 1 2 2 本次研究的目的 11 第二章 材料与方法 12 2 1 实验材料 12 2 2 实验方法 14 2 2 1 总 DNA 的提取 PCR 扩增及测序 14 2 2 2 数据统计分析 15 第三章 研究结果 17 3 1 DNA 条形码片段特征分析 17 3 2 DNA 条形码片段种内种间变异及 barcoding gap 评估 21 3 3 DNA 条形码片段物种分辨率评估 23 第四章 讨论 32 第五章 主要结论及展望 36 参考文献 37 硕士期间发表论文情况 44 致 谢 45 1 第一章第一章 前言前言 1 11 1 DNADNA 条形码条形码 DNA barcoding 1 1 11 1 1 DNADNA 条形码的概念条形码的概念及发展史及发展史 DNA 条形码 DNA barcoding 作为一项新型分子生物学物种鉴定方法 该技术旨在通过比较一段标准的 长度相对较短 400 800bp 且有足够变异的 DNA 区域以实现生物物种快速而准确的识别和鉴定 Hebert et al 2003 Hebert et al 2004a Hebert et al 2004b Hebert and Gregory 2005 Rogers et al 2007 DNA 条形码技术首先是从动物类群中发展起来的 2003 年 加拿大 University of Guelph 教授 加拿大皇家学会会员 Paul Hebert 从动物线粒体细胞色素 C 氧化 酶亚基 I cytochromecoxidase subunit I COI 基因上选取了一段长度约为 650bp 的片段 通过对 11 门 13320 种动物进行了分析并得出以下结论 在所分析的所 有物种中除了腔肠动物 Cnidaria 外 COI 基因在其它动物中均表现出良好的物 种分辨率 因此 Paul Hebert 提出可以采用单一的小片段基因进行生物物种的识 别和鉴定 而该技术的核心思想类似于超市条形码对不同商品的识别 但生物 DNA 条形码与商品条形码的差异在于 前者利用 4 个不同的碱基 C G A T 在基因中通过排列顺序的不同而实现生物物种的鉴定 由于 Paul Hebert 首先提议将该技术应用到生物界 因此他被称为 DNA 条形码之父 DNA 条形 码 DNA barcoding 技术的最终目的是通过一段或者几段标准的 DNA 片段能 够完成地球上所有生物物种的准确鉴定 Rogers et al 2007 物种的识别和鉴定是生物学的基石 Renvoize and Clayton 1986 以往生物 学家鉴定生物标本主要依赖传统的形态学特征进行生物物种鉴定 Briggs and Walters 1997 而传统的形态学分类方法至少存在以下两点不足 1 倘若标 本存在受损或缺乏容易区分的植物器官的情况下 即使是分类学专家也很难做 到对这类植物的准确鉴定 2 特别是对于形态学变异较大 分类上存在困难 的类群 比如兰科 禾本科植物 它们的准确鉴定需要经验丰富的分类学家耗 费大量的时间和精力才能实现 而一个专业的分类学家需要经过长期的培养 同时需要花费大量的时间和经费 Li et al 2011 随着分子生物学的发展 DNA 条形码技术的出现在一定程度上可以缓解传统分类学遇到的这些困境瓶颈 在 DNA 条形码 DNA barcoding 的概念提出以前 著名德国生物学家 Tautz 等已 经提出 DNA 分类学 DNA Taxonomy 的观点 即应用 DNA 序列对物种进行快 2 速鉴定可作为生物学的分类依据 Tautz et al 2002 2003 自从 2003 年 加拿大生物学家 Paul Hebert 在 DNA 分类学基础上第一次 提出 DNA 条形码 DNA barcoding 的概念提出以来 随后 很多研究者将精 力投入到 DNA 条形码的研究工作当中 一些研究者认为 DNA 条形码这种新型 分子生物学物种鉴定方法在未来将会取代传统分类学方法 Ebach and Holdrege 2005 而大多研究者认为 DNA 条形码技术为传统形态分类学中难以鉴定的生 物物种提供一种必要的补充手段 图 1 1 Mallet and Willmott 2003 Hebert and Gregory 2005 DNA 条形码与形态分类学修订的结合见图 1 1 起初 Paul Hebert 提出将线粒体细胞色素氧化酶 COI cytochrome c oxidase subunit I 基因作为动物通用的 DNA 条形码片段 并且在此后的动物类群研究中该观点得 到了成功的验证 如鱼类 Ward et al 2005 鸟类 Hebert et al 2004 Yoo et al 2006 Kerr et al 2007 Lijtmaer et al 2011 昆虫 Hajibabaei et al 2006 Craft et al 2010 两栖类 Vences et al 2005 Shen et al 2013 哺乳类 Murphy et al 2013 等 虽然 COI 片段被广泛应用到动物类群的研究中 但是植物线粒体基 因组较慢的进化速率使得 COI 片段并不适合植物类群的研究 Cho et al 2004 Cowan et al 2006 Fazekas et al 2008 因此 在核基因和叶绿体基因组中筛选 出一个或多个区域用于植物 DNA 条形码的鉴定将是研究者面临的一个首要问题 Cho et al 2004 Chase et al 2005 2004 年 一些研究机构及私人机构在美国华盛顿举办了一场关于 DNA 条 形码的研讨会 本该次大会的主要成效成果是设立了 生命条形码联盟 CBOL the Consortium for the Barcode of Life 该联盟的主要目的是通过建 立不同类群的 DNA 条形码数据库进而组建一个全球公众的生物 DNA 条形码 数据库 并最终实现数据库的共享 2005 年 全球第一届 DNA 条形码会议在 英国伦敦举行 本该次大会全面地对 DNA 条形码的概念 选择标准及其工作 流程做了详细的讨论 随后 一些研究者将 DNA 条形码的概念引入到植物学 研究中 Chase et al 2005 Kress et al 2005 2005 年 Kress et al 通过对整个 被子植物选用 10 个叶绿体 DNA 片段和 1 个核 DNA ITS 片段对整个被子植物 进行 DNA 了条形码的研究 研究结果表明 单个的叶绿体 rbcL 片段因为变异程 度低而不能很好的区分物种 而 trnH psbA 和 ITS 显示很好的物种分辨率 并 建议采用不同片段的组合进行物种鉴定 2006 年 Newmaster et al 对陆地植物 进行了 DNA 分子条形码研究 认为叶绿体 rbcL 片段在较高分类阶元上的具有很 好的物种鉴别率 2007 年 kress Kress et al 通过对陆地植物大尺度的取样和 研究 明确提出可将两个叶绿体 rbcL trnH psbA 的组合作为陆地植物的条形码 2008 年 Lahaye et al 对兰科植物采用 8 个叶绿体 DNA 片段对兰科植物进行了 3 条形码研究 最后提议叶绿体 matK 片段可作为有花植物的核心条形码 2009 年 生命条形码联盟 CBOL the Consortium for the Barcode of Life 利用 7 个候 选片段对陆地植物进行了研究 基于 PCR 扩增效率 DNA 测序成功率及其物 种鉴定率三方面综合考虑 建议组合片段 rbcL matK 可作为陆地植物鉴定的通 用的条形码 在随后的研究中 rbcL matK 组合得到大多研究者的基本认可 同 时提出叶绿体 trnH psbA 片段和核基因 ITS 片段可作为陆生植物鉴定的补充片 段 Hollingsworth et al 2009 2010 年 Chen et al 通过对 7 个候选片段 psbA trnH matK rbcL rpoC1 ycf5 ITS2 ITS 在药用植物中分辨率的比较 他们指出 ITS2 片段可作为有效 的条形码片段用于药用植物或者近缘植物的物种鉴定 同时他们从核基因 线 粒体和叶绿体基因组水平上总结了植物 DNA 条形码片段的优缺点 见 Chen et al 2010 图 1 2 2011 年 Li et al 为了评估植物核心条形码 rbcL matK 片 段和补充条形码 psbA trnH ITS ITS2 片段在种子植物中的有效性和通用性 采用四种不同的分析方法对收集到的 75 科 141 属 1757 种的 6286 个样本 1757 种 141 属 75 科植物进行 DNA 条形码研究 研究结果显示 核基因 ITS ITS2 片 段在这些样本中表现出最好的通用性和最高的物种鉴别率 因此 他们提议核 基因 ITS ITS2 应当作为种子植物的核心条形码片段 迄今为止 在植物类群中 还没有一个标准的条形码片段 而好的通用性 高的 PCR 扩增率和测序成功率 及高的物种鉴别率是评价一个理想 DNA 条形码片段的基本标准 Li et al 2011 4 图 1 2 三个植物基因组的候选条形码片段 引自 Chen et al 2010 Figure1 2 Genes from three genomes in plants that are candidate barcodes From Chen et al 2010 5 图 1 1 DNA 条形码与形态分类学修订的结合流程图 引自 Ren et al 2010 Figure1 1 Work map of the DNA barcoding and morphological taxonomy From Ren et al 2010 1 1 21 1 2 DNADNA 条形码的选择标准条形码的选择标准及优点及优点 DNA 条形码 DNA barcoding 的概念提出以后 很多研究者一直在寻找 一个标准的 DNA 片段来实现地球上所有生物物种的识别和鉴定 而一个理想的 DNA 条形码片段 应当满足以下几个标准 DNA 片段应当存在高度保守区域 该保守区主要是便于通用引物的设计 Kress et al 2005 Presting 2006 Sass et al 2007 Devey et al 2009 DNA 片段长度相对较短 约 400 800bp 主要 目的是便于 DNA 的提取和 PCR 的扩增 尤其是对于时间已久 DNA 存在降解 的一些样本 Taberlet et al 2007 物种间存在显著的遗传变异和分化 但在种 内水平上遗传变异应当足够的小 Hollingsworth et al 2009 在序列方面要求 尽可能不含有单核苷酸重复序列 不需要进行克隆 可以直接用于测序 DNA 条形码 DNA barcoding 技术相比传统形态学鉴定方法存在很多优 点 生物条形码联盟 CBOL 在 Barcoding Life Ten Reasons 一文中具体阐述了 DNA 条形码的优点 可简单概括为 1 通过一小块组织或器官实现物种的 鉴定 即使部分样本出现受损情况也不会影响到最终鉴定结果 2 可通过个 体不同的发育阶段实现对生物物种的准确鉴定 从幼虫的卵到成熟的个体及从 幼苗的种子到植物的开花繁殖整个过程 3 鉴定疑似种 通过 DNA 条形码 从分子水平上可以将形态学相似的物种区分开 4 可以帮助分类学的修订 利于隐形种 隐形种是指 由于物种之间形态学差异太小未能成功鉴定 而被划 分到一起的不同物种 的发现 所谓隐形种是指 由于物种之间形态学差异太小 未能成功鉴定 而被划分到一起的不同物种 5 通过基因水平识别生物 弥 补传统形态学方法的不足 利于新物种的发现 同时对生物物种多样性具有重 要意义 6 DNA 条形码扫描仪系统一旦建立 可以减少对分类学专家的依 赖 即使没有专业分类学背景的人群也可以对生物物种进行快速鉴定 由于一 个专业的分类学家需要经过长期的培训过程和丰富的分类学经验 同时对于一 些形态学上极为复杂的类群分类学家也很难做到准确鉴定 如兰科 禾本科植 物 DNA 条形码技术的产生在一定程度上可以缓解传统形态学分类中遇到的一 些困境 6 1 1 31 1 3 DNADNA 条形码的工作流程条形码的工作流程及分析方法及分析方法 一套成熟的 DNA 条形码工作流程对植物条形码的研究显得非常重要 很 多研究者对条形码的工作流程做了相关的报道 莫帮辉等 2008 彭居俐等 2008 闫化学等 2010 高连明等 2012 裴男才等 2013 大体流程概 括如下 1 查阅文献确认研究对象 2 样品的采集与保存 在样品采集时 大多研究者最关心的问题是多大的样本量适合于植物 DNA 条形码的研究 原 则上讲样本的数量应尽可能覆盖物种的整个分布区且来源于不同的居群 目前 植物 DNA 条形码的研究基本分为两种 其一关于特定科属的条形码研究 其 二关于区域或生态样方的条形码研究 对于前者样本的采集应最大限度的覆盖 物种的遗传变异范围 通常每个物种采集 8 10 个样本 且这些样本至少来自 5 个以上不同的居群 由于特定区域的物种 其种内遗传变异较小 因此每个物 种选取 2 3 个样本即可显示该物种的遗传变异范围 采集到的样本应当记录好 相关采集信息 主要包括标本采集信息 采集编号 采集人 采集时间 标本 鉴定信息 标本凭证信息 样品编号 凭证标本编号 标本存放处 样品提供 者 提供者联系方式 3 样品的形态学鉴定 通过形态学比较 对所采集样 品进行准确鉴定 并详细记录 4 引物的设计 目前大多研究者采用通用引 物进行植物 DNA 条形码的研究 见 高连明等 2012 5 对样本进行 DNA 的提取 其次进行 PCR 的扩增和测序获得 DNA 条形码序列 通过建立物种鉴 定的 DNA 条形码数据库 便于后续 DNA 条形码数据的分析和物种鉴定工作的 开展 6 数据的编辑 命名和提交 由于植物存在多个核心 DNA 条形码 为了防止不同条形码命名出现错误 我们针对不同植物 DNA 条形码应采用统 一的缩写格式 参考 Hollingsworth et al 2009 7 对获得的序列经仔细的校 正后 使用 PAUP4b10 或 MEGA5 0 软件计算种间和种内的 K2p 遗传距离 基 于 K2p 模型构建系统树进行 DNA 条形码数据分析 植物 DNA 条形码在分析之前 首先对 DNA 序列进行比对和人工校准 用 于序列比对的软件较多 如 ClustalW CODONCODE CodonCode Corporation Dedham MA USA 等 植物 DNA 条形码的分析方法较多 目前常用的主要有 以下三种分析方法 距离法 Distance Based Method 建树法 Tree Based Method 和 TaxonDNA 法 通常距离法和建树法会得到比较一致的物种分辨率 TaxonDNA 方法相比前两种分析方法物种分辨率较高 特别是对于不同片段的 组合获得的物种鉴别率更高 Li et al 2011 1 距离法 Distance Based Method 是使用不同的距离模型对不同片段种内和种间遗传距离进行比较的 一种方法 遗传距离的计算方法较多 不同研究者提出了不同的计算方法 7 2007 年 Kress and Erickson 使用 Wilcoxon Signed Rank Test 检验对不同片段的 种内和种间遗传距离做了比较 2008 年 Newmaster et al 利用 Mega3 1 软件下 的 pairwise uncorrected distance p distance 模型对肉豆蔻科植物的种内和种间 遗传变异做了分析 首先通过两两序列的比对 进而计算不同物种的种内和种 间遗传距离 当种内最大的遗传距离小于种间最小的遗传距离则认为物种鉴定 成功 Hollingsworth et al 2009 2009 年 生物条形码联盟 CBOL 推荐使 用 Kimura 2 parameter distance K2p distance 模型进行遗传距离的计算 早在 2005 年 Meyer and Paulay 提出 barcoding gap 可作为评估一个理想条形码 的重要指标 所谓 barcoding gap 是使用不同的分析软件计算种内和种间遗 传距离 再用柱状图表示种内和种间的遗传距离分布频率 一个理想的 DNA 条形码种内遗传距离应明显小于种间距离 并且种间和种内遗传距离之间会形 成一个显著的间隔区 2 建树法 Tree Based Method 首先是通过多序列 进行比对 通常基于 K2p 模型 应用 PAUP4b10 MEGA5 0 或 MrBayes software 等软件构建 Neighbor joining NJ Maximum likelihood ML Maximum parsimony MP Bayesian inference BI 等系统发育树 发育系统 树的建立并不是研究物种间的系统发育关系 而是检验不同物种的单系性 即 同一物种的所有样本在发育树上是否全部聚为一支 通常对同一物种的所有个 体在系统发育树上形成单系分支时则认为该物种鉴定成功 对于不同物种的个 体在系统发育树上聚在一起时则认为这些物种均不能成功鉴定 Li et al 2011 3 TaxonDNA 方法 是基于序列相似性进行物种鉴定的一种方法 首先通过 实验工作创建物种的序列数据库 其次确定一个阈值 再次将未知样本 DNA 序列与数据库序列进行比对 如果在数据库中可以搜索到未知序列及同一物种 的序列 则认为该未知样本可以成功鉴定 反之则鉴定失败 Meier et al 2006 1 1 41 1 4 DNADNA 条形码存在的问题及发展前景条形码存在的问题及发展前景 动物 DNA 条形码相对植物条形码发展较早且迅速 由于植物 DNA 条形码 的发展处于探索阶段 目前我们尚未获得像动物条形码 COI 一样的标准植物 DNA 条形码片段 虽然植物 DNA 条形码也取得了一些进步 但也受到不少研 究者的质疑 Ebach and Holdrege 2005 Rubinoff et al 2006 目前存在的主要争 议有 1 大多研究者只在特定区域采集样本或只对每个物种的 1 到 2 个样本 进行取样分析 在这种情况下样本覆盖范围显然太小不能准确反映该物种的遗 传变异 Dasmahapatra and Mallet 2006 2 生命条形码联盟 CBOL 2009 推荐使用的植物核心条形码 rbcL matK 片段 其分子进化速率较慢 且该组合 8 对经历了过快速进化或辐射分化的物种分辨率较低 因此该组合片段还不能作 为标准植物 DNA 条形码片段 3 DNA 条形码技术不仅依赖传统形态学鉴定 而且可以对形态学分类进行修订 但目前还不能将传统形态学鉴定方法与 DNA 条形码技术完美地结合起来 4 在植物类群中杂交和基因渐渗比较频繁 无 疑为植物 DNA 条形码的研究造成了很大的困难 虽然植物 DNA 条形码还存在一些争议 但随着 DNA 测序技术 信息技术 及分子生物学的发展 将无疑为植物 DNA 条形码体系的完善提供极大的便利 和动力 而完善的条形码体系对分类学的修订 隐型种和新种的发现 濒危物 种的保护 生态问题的解决 生物多样性的保护 生态监测 食品安全方面及 中药鉴定等方面将提供新的思路 Armstrong and Ball 2005 Dayrat 2005 Fitzhugh 2006 Agnarsson and Kuntner 2007 van Velzen et al 2007 1 21 2 川木香属概述及本川木香属概述及本次次研究的目的研究的目的 1 2 11 2 1 川木香属概述川木香属概述 青藏高原 The Qinghai Tibet Plateau 总面积约 250 万平方公里 平均海 拔约 4000 多米 是地球上面积最大 海拔最高的高原 Zheng 1996 青藏高原 大约在 5000 万年或更早时期开始隆升 但直到第三纪中新世或上新世才开始迅 速隆升 因此也有地球上最年轻的高原之称 Tapponnier et al 2001 青藏高原 及其邻近地区不仅是生物学家进行物种分化及生物多样性研究的热点地区之一 而且有大量的特有属和特有种存在 Myers et al 2000 Mittermeier et al 2005 据 记载 这些地区大约含有 189 科 1174 属 4385 种植物 Wu 1980 这些植物中 大约 50 个属 20 的种被确认为该地区的特有属和特有种 Wu 1980 1987 川 木香属是青藏高原及其邻近地区的一个特有属 隶属于菊科 Asteraceae 菜蓟族 Cardueae Cass 飞廉亚族 Carduinae O Hoffm 目前 据 中国植物志 记载 川木香属被界定大约 12 15 个种 大多分布于我国的西南部 该属作为 青藏高原及其邻近地区的特有属之一 多生长于海拔 2900 4800 米的高山草甸 高山山脊 林缘 河边烁石及灌丛等地 Yong 1965 Wang et al 2007 Shi 2011 另外 该属多种植物在中国中草药中有着具有非常重要的药用和经济价值 石 铸 1987 川木香属 Dolomiaea 是菊科 Asteraceae 菜蓟族 Cardueae Cass 飞廉亚族 Carduinae O Hoffm 中的一个小属 该属植物均为多年生草 本 一般为莲座状 无茎或很少有茎 根多且较粗 头状花序单生至多数密集 于茎基顶端的苞叶群中或莲座状叶丛中 所有小花两性 结实 管状 花冠红 色或紫色 外部有腺点 花药基部附属物类似尾状 有乳突 撕裂 花丝出现 Comment o1 这一段是否太多 可 以精简 9 分离 没有毛 花柱分枝细长形或线形 花柱两裂或顶端尖细 贴合 较短 顶端圆形 总苞球状 钟状或倒卵状 总苞片多层 覆瓦状排列 多少革质或 上部草质坚硬 顶端常有软骨质或刺状小尖头 全缘存在睫毛 瘦果几圆柱状 或三至四棱形 顶端存在果缘 基底着生面平 冠毛两至多层 近等长或外层 稍短 黄褐色 基部连合成环状 整体脱落 冠毛刚毛容易脆折 锯齿状 短 羽毛状或粗毛状 石铸 1987 据 中国植物志 记载 该属包括云香组 Sect Vladimiria 和川木香组 Sect Dolomiaea 两个大组 这两个组划分的 依据是 云香组 花柱分支细长 线性 顶端尖细 张开 川木香组 花柱分 支短 贴合 顶端圆形 每种植物形态特征详见如下川木香属植物分种检索表 1 1 引自 中国植物志 川木香属是菊科中最新划分出来的一个属 该属是最初由 De Candolle 于 1833 年基于喜马拉雅山一带的模式种 Dolomiaea macrocephala DC 而建立的单 种属 然而由于当时认识的局限性 该属建立之初并没有得分类学家的认可 并且存在很大的争议 一些分类学家认为该单种属与苓菊属 Jurinea 和飞廉 属 Carduus 植物在形态学上及为相似 因此提议应将该模式种 D macrocephala 划入苓菊属 10 1 花柱分支细长 线形 张开 顶端尖细 云香组 Sect Vladimiria Iljin Shih 2 头状花序少数或多数 通常 2 3 8 个集生于茎基顶端的莲座状叶丛中 3 冠毛立生 不会反向包裹瘦果 4 叶质地薄 不分裂 边缘有大小不等的尖齿 1 越隽川木香 D dentieulata Ling Shih 4 叶质地厚 羽状分裂 5 叶两面被稀疏的长或短糙毛 2 膜缘川木香 D forrestii Diels Shih 5 叶两面被绒毛或至少下面的绒毛密厚或稠密 6 叶线状长椭圆形或宽线形 皱波状羽状深裂 两面同色 灰白色 两面被蛛丝状薄绒毛 3 皱叶川木香 D crispo undulata Chang Ling 6 叶长椭圆状 羽状全裂 叶正反异色 上绿 无毛 下灰白 被密厚的绒毛 4 糙羽川木香 D scabrida Shih et S Y Jin Shih 3 全部或仅外层冠毛刚毛皱曲反折 反包并紧贴瘦果 5 川木香 D souliei Franch Shih 2 植株仅 1 枝花序 头状 单生于茎底部 顶端莲座形 叶丛中或茎顶端的苞叶群中 7 叶片无分裂 边缘没有锯齿或存在锯齿或小尖头 8 叶大型 卵圆形 边缘存锯齿或小尖头 两面粗糙 被短毛 6 厚叶川木香 D berardioidea Franch Shih 8 叶小型 长椭圆形 倒波针形或匙形 边缘无锯齿亦无小尖头 两面无毛 7 腺叶川木香 D georgii Anth Shih 7 叶型羽状分裂或者存在部分羽状分裂的叶 9 叶片两面颜色相同 绿色或下面浅色 两面有糙毛或者无毛 10 叶大型 叶或羽裂片边缘有少锯齿或小尖头 两面被糙毛 8 菜木香 D edulis Frangch Shih 10 叶小型 羽裂片边缘既无锯齿亦无小尖头 两面光滑无毛 9 怒江川木香 D salwinensis Hand Mazz Shih 9 叶两面不同色 上绿 仅在脉部有蛛丝毛 下灰白 被厚绒毛 10 平苞川木香 D platyepis Hand Mazz Shih 1 花柱 2 裂 极短 贴合 顶端圆形 川木香组 Sect Dolomiaea Iljin Shih 11 叶大型 长 10 20 厘米 不规则二回羽状分裂或含有再次羽状分裂的叶裂片 一回侧裂片较大 多对 7 至 10 对 顶部裂片较宽大 头状花序多数 10 25 个 集生于茎基顶端的莲座状叶丛中 11 美叶川木香 D calophylla Ling 11 叶小型 长 6 9 厘米 大头羽状分裂 顶端裂片较大 测裂片较小 4 6 对 头状花序少数 4 6 个 集生于茎基顶端的莲座状叶基中 12 西藏川木香 D wardii Hand Mazz Ling 表 1 1 川木香属植物分种检索表 引自 中国植物志 11 或飞廉属中 1939 年 Iljin 在种 V salwinensis Hand Mzt Ilj 种的基础上建 立了 Vladimitia Ilj 属 并在后来的研究中将其划入风毛菊属 Saussurea 与 麻花头属 Serratula 附近 直到 1965 年 林镕通过对菊科三个近缘属植物进 行了系统的形态学研究 他指出 Vladimitia Ilj 属的建立是正确的 并正式确立 了该属的系统学位置 同时他根据花粉 廋果 形态学等方面的比较 认为川 木香属 Vladimitia Ilj 的确是一个单独属 并且与风毛菊属植物有较近的亲缘关 系 二者很可能有着共同的起源 而它们在冠毛上表现出明显的差别 最后指 出 Vladimitia Ilj 属大约有 5 个种 而这些植物大多是不同植物学家早期将它们 归入到了苓菊属当中 1986 年 Shi 详细探讨了川木香属植物的界限问题 他 认为 Vladimitia Ilj 属与 Dolomiaea DC 属在生境和花絮方面几乎没有什么差 别 因此提出 Vladimitia Ilj 属应当并入到 Dolomiaea DC 属中 并作为其中 的一个组更为合理 根据该属植物花柱性质的不同 从形态学上将川木香属划 分为川木香组和云香组两个大组共 12 种植物 并对这些植物做了详细的记载 云香组主要包括 越隽川木香 D dentieulata 膜缘川木香 D forrestii 皱 叶川木香 D crispo undulata 糙羽川木香 D scabrida 厚叶川木香 D berardioidea 腺叶川木香 D georgii 菜木香 D edulis 怒江川木香 D salwinensis 平苞川木香 D platyepis 川木香组主要包括 美叶川木香 D calophylla 西藏川木香 D wardii 1994 年 Shi 在植物分类学报上发表川 木香属的一个新种红冠川木香 其冠毛刚毛下半部分为褐色 上半部分为土红 色 与属内其它植物存在明显的形态学差异 随后 该属植物的形态学分类得 到大多分类学家的普遍认可 王玉金 2007 及王曦 2013 分别对青藏高原 三个特有属植物基于 trnL F ITS 和 psbA trnH 三个 DNA 序列进行了系统发 育分析和 并对青藏高原特有属川木香属核型进行了研究 从分子系统发育分 析得到川木香属是苓菊属 Jurinea 及其近缘属的姊妹群 并认为该属最早位 于风毛菊属中 随后从风毛菊属中划分出来 而各自独立成属的云木香 Aucklandia costus 和大序齿冠 Frolovia frolovii 两个物种总是嵌套于川木 香属中 可见这两个物种确实应该从风毛菊属中划分出来 但目前它们还不能 独立成属 应改将其划并入川木香属中更为合理 从细胞学中的而染色体数目 和结构分析 目前还不能把形态学上划分的两个大组完全区分开来 可见 分 子系统学 细胞学和传统的形态学分类存在不一致现象 那么这种不一致还需 要其它数据进一步深入研究来确定 目前 据 中国植物志 记载 川木香属被界定大约 12 15 个种 该属均 为多年生草本植物 大多分布于我国的西南部 作为青藏高原及其邻近地区的 特有属之一 多生长于海拔 2900 4800 米的高山草甸 高山山脊 林缘 河边 12 烁石及灌丛等地 Yong 1965 Wang et al 2007 Shi 2011 1 2 21 2 2 本本次次研究的目的研究的目的 川木香属中多种植物的根都可作为重要的药用植物 性味辛 苦 温 石 铸 1987 川木香在藏药 中药及羌药中有很大的药用价值 郭全兴 2001 川木香 该属物种不仅具有行气止痛 止泻功效 而且是治疗胃肠疾病的常用 药 石铸 1987 同时具有抗菌 抑制血小板聚集 降血糖等作用 王战国等 2006 这些药用资源大多为野生植物 随着植被的破坏和人为的任意开采 目 前川木香属药用植物资源面临着巨大的危机 早期已经将其纳入濒危二级保护 品种目录藏药物种目录当中 李隆云等 2002 由于川木香属植物与苓菊属 Jurinea 及其近缘属植物在形态学上极为相似 且该属植物存在极大的形态 学变异 传统的形态学鉴定方法对该属植物的准确鉴定存在一定的困难 本研究对分布于青藏高原及其邻近地区的特有属川木香属 15 个物种 122 个 个体使用 5 套叶绿体 matK M rbcL R trnH psbA H trnL F L 和 psbK psbI P 片段 1 套核基因 ITS 片段及它们的组合数据进行了条形码的研究 本 研究的具体目的是 1 测试 DNA 条形码片段的通用性 为植物条形码的研 究起到一定的推动作用 2 能否寻找到最适合的 DNA 条形码片段 为川木 香属植物的物种鉴定提供一种分子鉴定手段 3 为川木香属及其它药用植物 DNA 条形码体系的建立起到一定的借鉴作用 13 第二章第二章 材料与方法材料与方法 2 12 1 实验材料实验材料 本实验以川木香属 15 种植物 共计 122 份样品为实验材料 采集范围主要 涉及青藏高原及其邻近地区 几乎涵盖了该属植物的主要分布区 采集材料时 每个居群选取 3 个以上的个体 每个个体选取 3 4 片鲜叶 个体之间至少间隔 300 米的标准 为了保证植物叶片中基因组 DNA 的完整性 我们将采集到的新 鲜叶片置于存有变色硅胶的自封袋中进行干燥 并依据变色硅胶的颜色情况不 定期地更换硅胶 直到变色硅胶不变色 对其密封保