重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

重组质粒的酶切鉴定及重组质粒的酶切鉴定及 PCR 实验实验 陈倩倩 交流生 118627140313 一 实验目的 1 检验重组质粒的插入片段的大小 2 学习 PCR 技术的使用 二 实验原理 PCR 技术类似于 DNA 的天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸 引物 PCR 由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 模板 DNA 的变性 模板 DNA 经 加热至 93 左右一定时间后 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成 为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板 DNA 与引物的退火 复性 模板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 55 左右 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA 模板 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下 以 dNTP 为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留 复制链重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新 链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需 2 4 分钟 2 3 小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍 到达平台期 Plateau 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 PCR 的三个反应步骤反复进行 使 DNA 扩增量呈指数上升 反应最终的 DNA 扩增量可 用 Y 1 X n 计算 Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数 X 表示平 Y 均每次的扩增效率 n 代表循环次数 平均扩增效率的理论值为 100 但在实际反应中平均效率达不到理论值 反应初期 靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式 随着 PCR 产物的逐渐积累 被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加 而进入线性增长期或静止期 即出现 停滞效应 这种效应称平台 期数 PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素 大多 数情况下 平台期的到来是不可避免的 PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分 短产物片段的长度严格地限定在 两个引物链 5 端之间 是需要扩增的特定片段 短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的 以一个原始模板为例 在第一个反应周期中 以两条互补的 DNA 为模板 引物是从 3 端开始延伸 其 5 端是固定的 3 端则没有固定的止点 长 短不一 这就是 长产物片段 进入第二周期后 引物除与原始模板结合外 还要同新合 成的链 即 长产物片段 结合 引物在与新链结合时 由于新链模板的 5 端序列是固 定的 这就等于这次延伸的片段 3 端被固定了止点 保证了新片段的起点和止点都限定 于引物扩增序列以内 形成长短一致的 短产物片段 不难看出 短产物片段 是按指数 倍数增加 而 长产物片段 则以算术倍数增加 几乎可以忽略不计 这使得 PCR 的反应 产物不需要再纯化 就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用 三 实验材料及仪器 高速离心机 微波炉 电泳仪 制胶槽 电泳槽 梳子 锥形瓶 量筒 移液枪 冰盒 枪尖 Eppendorf 管 微量移液器 手套 记号笔 TAE 电泳缓冲液 10 琼脂糖 溴化 乙锭 EB DNA 相对分子质量标准物 DNA Marker k Hind DL5000 四 实验步骤 一 重组质粒的酶切 电泳检测 1 按下表加样进行加样后 37 水浴 1h 重组 DNA13 2 ldd H2O1 6 l Buf 2 lHind 2 l 作用 用 Hind 将重组 DNA 切成片段 2 将酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳测试 如图所示 我组的重组质粒酶切后出现三条带 大小在 9416 6557bp 之间此带为插入的 DNA 片段 在 DNA Hind 的 4361bp 和 2322bp 之间的条带 并且稍快于 DL5000 的 3000bp 的条带 估测可能在 2000 3000bp 之间 此为切去外源片段以后的载体片段 在 DL5000 的 100bp 和 250bp 之间的条带 估计可能为 200 150bp 之间 此片段也 为插入的 DNA 片段 第一条带最为明亮 第二条次之 最后一条非常模糊 这是因为第一条为插入的大片 段 DNA 所以在片段数相同的情况下 所含碱基最多其双螺旋中插入的溴化乙锭最多 因 此紫外照射后荧光最亮 第二条带与 DL5000 的 3000bp 条带对比 其片段大小所差不多 但是亮度几乎是 DL5000 的 3000bp 条带的两倍 可见我组提取的质粒 DNA 比较多 即重组 子其在细胞中的拷贝数比较多 二 PCR PCR 反应体系如下所示 ddH2O 13 2 l引物2 l buf 2 l模板1 l dNTP 1 6 lTqa 酶0 2 l 引物此次重组用到的载体是 p UC19 限制性内切酶为 Hind 所以选择 Hind 酶切位 点两侧一定距离的序列制作引物 pUC19 部分序列为 我组的质 粒 DNA 我组酶切 结果 DL5000 M13F 47 EcoR cgccagggttttcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcag gcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc Hind M13R 48 互补链 PCR 引物为 引物名称引物序列 5 3 引物长度 mers Tm M13F 47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC2464 7 M13R 48 GAGCGGATAACAATTTCACACAGG2457 9 反应程序 琼脂糖凝胶电泳检测 点样 10 l 结果如下 1 如图所示 我组的 PCR 条带在 DL5000 的第五 1000bp 和第六条带 750bp 之 间 说明该条带的大小应该介于 1000bp 和 750bp 之间 2 点样 10 l 的情况下与相同量的 Marker 对比 PCR 的 DNA 条带极其明亮说明 PCR 产量很高 1 94 3min 预变性 预变性是让 DNA 双链充分解离 然后第一次退 火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这 主要是为了保险起见 使模板 DNA 的二级结构充 分打开 2 94 30s 变性通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂 双链解 离形成单链 DNA 3 58 30s 退火当温度突然降低时由于模板分子结构较引物 要复杂的多 而且反应体系中引物 DNA 量大大多 于模板 DNA 使引物和其互补的模板在局部形成杂 交链 而模板 DNA 双链之间互补的机会较少 4 72 1min 延伸在 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核糖核苷三磷酸底 物及 Mg 离子存在的条件下 5 3 的聚合酶 催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应 5 72 10min循环完成后 使 PCR 反应完全以提高扩增产 量 在用普通 Taq 酶进行 PCR 扩增时在产物末 端加 A 尾的作用 可以直接用于 TA 克隆的进行 6 10 2h 我组 PCR 情况 五 注意事项 操作时应小心轻柔 防止将 DNA 吸入加样枪内或溅出离心管外 酶切时取酶时注意 枪尖不要伸入液面以下太多 以免枪尖外壁沾染过多的酶 分子生