东亚蝎毒蛋白的结构与功能生物科学

东亚蝎毒蛋白的结构与功能 摘要 东亚钳蝎是一种广泛分布于中国的蝎种 作为一种名贵药材 用于治疗各种神经系统疾病已有千年历史 东亚钳蝎的蝎毒毒性软 弱 不能使人致命 而且从东亚钳蝎粗毒已经发现一些具有药物活 性的多肽 研究这些毒素的结构与功能对相关的研究开发也具有重 要价值 关键词关键词 天然毒素 植物抗真菌多肽 晶体结构 原子分辨率 前言 前言 东亚钳蝎是我国的主要蝎种 广泛分布于中国西北部 蒙 古及韩国 毒性温和 毒液中富含生物活性多肽物质 有极大的药 物价值 几千年前 蝎煎剂就被用来治疗中风等疾病 近年来又发 现其含有抗癌多肽 抗癫痫肽 抗菌肽等 其中主要药效部位在蝎 毒 蝎的毒液主要成分是具有生物活性的多肽 即蝎毒素 同时它 们作为未来新型的药物也正展示出十分诱人的潜力和前景 因而结 合生化 电生理 药理和免疫学等实验技术 利用分子生物学概念 和方法 进一步地在基因水平上揭示蝎毒素讨其开发应用的价值已 成为当前学术界中一个具有相当吸引力的研究热点并已取得了重要 进展 1 1 蝎毒素基因的获取及其在大肠杆菌等宿主内的表达蝎毒素基因的获取及其在大肠杆菌等宿主内的表达 Ll 化学合成基因化学合成基因具有简便快速准确的优点 通常被应用于一 些属短肤链蝎神经毒素 如 MgTx chTx BeISA Betl 等的研究 以其中 MgTx 为例 11 MgTX 是一个由 39 个氨基酸残基构成 选择性地阻断电压依赖性 K 通 道的毒素多肤 但学术界在过去相对一段时间内对蝎毒中是否真实地含有该短 肤类毒素存在着争议 早期曾有报道认为类似 MgTX 一类短肤链毒素的生物活性 功能可能是由于其它毒素多肤污染所至 Margarita 等根据已知的 MgTX 氨基酸 序列 合成了两个 89mers 寡聚核昔酸 每个寡聚核昔酸的 5 末端插入了 5 个 脱氧胞啥咤碱基以利限制性内切酶酶切 寡聚核昔酸经纯化且退火后 用 sequenaseDNA 聚合酶补齐 再经限制性内切酶酶切 得到的片断经纯化后连接 到 pCSP105 质粒中 最终移至 E Co BLZI DE 中进行表达 图 l 表达的产物 为 MgTX 与 T7 基因一 9 相融合的蛋白 经蛋白酶 FactorXa 剪切后获得了高表达 产率的重组 MgTx 多肤 rMgTx 3 一 4mg L 培养液 rMgTx 与天然 MgTx 两者间 无论分子结构或其功能特征均呈现出完全的对应一致性 从而不但为探讨 MgTx 分子水平的结构与功能关系提供了新的手段和依据 同时证实了 MgTX 这类多肤 确实是存在于蝎毒中的天然活性物质 1 1 2 2 构建蝎毒构建蝎毒 cDNAcDNA 基因文库基因文库 构建蝎毒 cDNA 文库 从中筛选相关毒素基因是当今研究蝎神经毒素分子特 征的重要途径之一 并已得到了广泛的应用 与化学合成基因相比 该法的优 点在于可从文库中筛选多个毒素基因 迄今 已建蝎毒 cDNA 文库的蝎品种有 枷 thotos 扣 da eos Aod 阳 etonosaost 八 sHector 乃匆 se la 她 以 及中国的东亚钳蝎刀 认 ma 代 eos Karsch 等 从中筛选出的基因大多为 属 Na 十通道阻断剂一类的长链毒素多肤 如 TsW TsVll BjITZ AaHr AaHI AaHn AaHITI AaHITZ 和 BmKI 等 卜 4 由此不但解决了蝎毒素多肤含量少 分离纯化困难的问题 而且使得人们进一 步加深了对这些毒素多肤基因水平特征的认识 L3 利用分子生物学构建生物杀 虫剂和抗昆虫植物早在 1988 年 CarboreU 等曾将化学合成并经 E co 八扩增的 BeIT 抗昆虫毒素的基因克隆 112bp 导入 AeMNPV Auto 歹 aPhaCa 玫 rohaeanuclearpolyhedro 515virus Auto 盯 aPhaCalifor 苗 ea 核多角粒子病 毒 的 DNA 基因组中进行表达 然而当他们用携带 BeIT 基因的病毒对 sPod 叩 tera 加乡 perda sf 细胞进行感染 检测毒素的表达时 发现毒素的表达率较 低 并且当被感染的 sf 细胞抽提液或培养液注入苍蝇幼虫体内后 并未观察到 对昆虫的麻痹毒性效应阁 1990 年 英国 NERC 病毒和环境微生物学研究所的 Ste t 等将 AaHIT 抗昆虫毒素基因导入 BaculoviruS 载体中 结果大大增强了 病毒抗虫害的能力 且病毒对昆虫的半致死剂量和时间均明显降低 Ie 同年 Mccutchen 等也报道了类似成功的工作图 1992 年 Pangshengzhi 等将抗昆虫 毒素短肤 BeISA 的基因导入烟草基因组中 尝试构建新型抗昆虫植物体系 但 经生物检测发现 导入 BeIToA 基因的烟草植物抗昆虫能力没有明显的提高 推 测其原因可能是由于生成的毒素多肤分子中二硫配对误差导致不适当的分子折 叠结构所致 Is 1994 年 Martin Eauelaire 等报道了 AaHITI 基因在酵母中的 表达 虽然被表达的产物得率相对较低 4 拼 g L 培养基 但却显现出完全因 素 毒素多肚在酵母中的合成率低 素多肤在酵母中的稳定性差 毒素多肚 对酵母有毒性效应 I0 2 2 姻神经毒素的墓因水平认识姻神经毒素的墓因水平认识 2 12 1 蝎神经毒素基因结构的特征蝎神经毒素基因结构的特征 在已被克隆的蝎神经毒素基因中 T VII 是一个较详细地在基因组水平上 阐明其结构特征的多肤 fl0 在编码 T Vn 的基因中含有 一个 475bp 的 intron 由 20 个氨基酸残基构成的信号肤 与成熟 ToVll 相比 其相应于多 肤 C 一端的置处多了 3 个氨基酸 即 GKK 的编码核昔酸 且成熟多肤 C 末端残 基是被酞胺化 2 22 2 蝎毒素的生物合成过程蝎神经毒素蝎毒素的生物合成过程蝎神经毒素 基因转录后 intron 可在 mRNA 成熟过程中被剪接 而成熟多肤则是由 mRNA 翻译成的多肤前体 precusor 经再加工后的产物 以 TsVII 为例 它的前 体翻译后加工步骤可能为 首先由信号肤酶 signalpePtidase 将信号肤切除 由特异的狡肤酶 Carb 田守 pePtidase 末端剩余的 Gly 残基被一种 a 一酞胺 化酶 amidat 吨 eoyme 切除 并将 C 一末端残基酞胺化 然而各种蝎毒素前 体的信号肤和 C 一末端残基不尽相同 其翻译后加工的步骤想必差异较大 有 的 C 一末端残基与天然毒素多肤相同无需加工处理 有的 C 一末端部位只多了一 个碱性氨基酸残基 需经特异性狡肤酶切除 而有的 C 一末端虽含有 Gly 残基 但却不能被酞胺化酶作用 尽管目前对上述现象尚无统一的解释 但是蝎毒素 多肤的 C 一末端酞胺化对其生物活性是否起着重要的作用已成为颇值得追究的 疑题 2 32 3 蝎毒素分子的定点突变蝎毒素分子的定点突变 与 MgTX 不同的是 ChTX 不但是一个对电压依赖型 K 十通道 也是对 Ca2 激活的 K 十通道具有很高选择性的阻断剂 它由 37 个残基组成 其分子中含有 丰富的碱性残基 4 个 Lys 3 个 Arg 和 i 个 His 即便是在 pH 中性条件下 其 分子仍带有 5 至 6 个净正电荷数 因而推测位于 ChTX 分子表面带正电荷的残基 可能在其与 K 通道蛋白的细胞外口 mouth 带负电荷的残基或区域的相互识别 和结合过程中起着关键作用 为验证这一推测 Park 等对 ChTX 分子中的碱性 残基逐一进行了定点突变的研究 实验结果表明 ChTX 分子分别经突变后对毒 素与其靶通道相互结合的 34 用一个中性的残基 Gh 取代后 造成了毒素与靶通 道受体结合的解离常数升高 结合力大大降低 由此提示 ChTX 分子中 Arg 25 Lys 一 27 和 Arg 343 个带正电荷残基可能处于多肤分子表面相近位置而构 成了一个活性区域 而另 5 个碱性残基则分布于另一侧相反的位置 并推测碱 性残基与靶离子通道的相互作用方式或是通过微弱的空间静电荷的影响 或是 直接与通道的紧密结合 111 此外 利用基因定点突变将 MgTX 分子中碱性残 基 His 一 39 由另一个中性氨基酸残基 Asn 39 取代后 同样发现毒素与靶通道 受体结合的解离常数升高 从而导致了其与通道的结合效应降低了近百分之九 十 ll 3 3 展望展望 当今对蝎毒及蝎神经毒素的研究已远远超出了起初的蝎中毒救治和蝎公害防抬 的公共医疗健康范畴 从蝎毒中发现的各种具独特功能的神经毒素作为探讨各 类相关靶离子通道的蛋白成份及其调控细胞活动分子机理十分有效的探针 正 受到从事神经生物科学工作者的青睐 仅 1993 和 1994 年国际上这方面文章已达 到 200 篇 众所周知 近 10 多年来对电压依赖性 Na 通道研究的系列性重大 进展便是以蝎神经毒素及河豚毒素等的广泛应用而取得的 另一方面 除个别 蝎神经毒素已被开发成实验室商品 如 ChTx 和 IbTx 短肚神经毒素目前国际市场 价高达每毫克 200 多美元外 一些具有未来新型药物开发应用价值的蝎神经毒 素多肤同样正受到人们的格外重视 如文中提到的一类选择性抗昆虫毒素 insect spee 沮 eseo 印 ionneurotoxms 已成为构建未来新型生物杀虫剂和抗 虫害植物体系的择选分子模板 因而利用分子生物学的概念和技术不但有助于 更深入地研究蝎神经毒素及其相关靶受体的分子特征和构效关系 更积极的意 义在于以蝎毒素特异结合靶位和作用机理信息为基础 可在克隆表达的相关靶 受体上设计和筛分新的高效药物 并为蝎毒素资源的实际开发利用 包括其基因 的克隆 表达及宿主细胞的导