植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定 1 表型变化 鲜重 株高 主根长和叶面积 鲜重 取处理好的植株 擦干根和叶表面水分 测量整株植物的重量 每个测 6个重复 株高 取处理好的植株 测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度 记录 每个 测 6个重复 主根长 取处理好的植株 测量从根和茎分隔处到主根最远点长度 记录 每个 测 6个重复 叶面积 取处理好的植株 选择第二节段的叶片 测量叶面积 叶面积测量方法 是测每个叶片最宽处长度作为叶的长 测叶片最窄处长度作为叶的宽 叶片长和 宽的乘积即为叶表面积 每个测 6个重复 2 总蛋白 可溶性糖 丙二醛 MDA 和 H2O2含量测定 样品处理 取 0 5g 样品 叶片要去除叶脉 根要先用清水清洗干净 速在 液氮中冻存 在遇冷的研钵中加液氮研磨 然后加入 1 5ml 的 Tris HCl pH7 4 抽提 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中 于 4 12000rpm 离心 15min 取上清 保存在 20 下 上清液可用于总蛋白 丙二醛 MDA 可溶性糖和 H2O2含 量测定 总蛋白测定 Bradford 法 样品反应体系 800ul H2O 200ul Bradford 5ul样 品 空 白对 照 为 800ul H2O 200ul Bradford 测 定 后 带 入 标 准 曲 线 Y 32 549X 0 224 Y代表蛋白含量 X 代表 OD595 计算得出蛋白含量 可溶性糖测定 样品反应体系 1ml 蒽酮 180ul ddH2O 20ul样品提取液 空 白 对 照 1ml 蒽 酮 180ul ddH2O 测 定 OD625后 带 入 标 准 曲 线 Y 0 0345X 0 0204 Y代表 OD625 X 代表可溶性糖含量 ug 蒽酮配方 称取 100mg 蒽酮溶于 100ml 稀硫酸 76ml 浓硫酸 30mlH2O 注意 浓硫酸加入水中时 一点一点递加 小心溅出受伤 丙二醛 MDA 测定 在酸性和高温条件下 丙二醛可与硫代巴比妥 TBA 反应生成红棕色的 3 5 5 三甲基恶唑 2 4 二酮 在 532nm 处有最大吸收波长 但 该反应受可溶性糖的极大干扰 糖与 TBA 的反应产物在 532nm 处也有吸收 但 其最大吸收波长在 450nm 处 采用双组分分光光度法 可计算出 MDA 含量 MDA 的计算公式为 MDA umol L 6 45OD532 0 56OD450 反应体系为 400ul 0 6 TBA 350ul H2O 50ul样品 80 水浴 10min 后 测 OD532和 OD450 对照用 Tris HCl 0 6 TBA配方 称取硫代巴比妥 0 6g 溶于少量 1M NaOH中 待其完全 溶解后用 10 TCA 称取 10gTCA 三氯乙酸 溶于 100ml 蒸馏水中 待其溶解 即可定容至 100ml H2O2测定 二甲酚橙法 样品反应体系 82ul 溶液 A 820ul溶液 B A B 1 10 150ul样品提取液 30 水浴 30min 测 OD560 标准曲线 为 Y 0 01734X 0 0555 Y代表 OD560 X 代表 H2O2含量 溶液 A 200ml FeSO4 7H2O 0 1835g NH42SO4 0 0872g H2SO4 浓硫 酸 18M4 58ml 加水定容 溶液 B 200ml 二甲酚橙 0 0234g 山梨醇 6g 加水定容到 200ml 3 可溶性蛋白 SOD POD 和 CAT 活性测定 样品处理 取 0 5g 样品 速在液氮中冻存 在遇冷的研钵中加液氮研磨 然后加入 1 5ml 的 Tris HCl pH7 0 内含有 20 甘油 1mmol L ASA 抗坏血 酸 1mmol L DTT 二硫苏糖醇 1mmol L EDTA 1mmol L GSH 还原型谷 胱甘肽 5mmol L MgCl2抽提 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中 于 4 12000rpm 离心 15min 取上清 保存在 20 下 上清液可用于可溶性蛋白 SOD POD 和 CAT 含量测定 1mmol L的 ASA 配制 先配制 10mmol L的母液 称取 176 13mg 的 ASA 溶于 100ml 的 Tris HCl pH7 0中即可 然后稀释 10倍即可 1mmol L的 DTT 配制 先配制 10mmol L的母液 称取 154 25mg 的 DDT 溶于 100 ml的 Tris HCl pH7 0中即可 然后稀释 10倍即可 1mmol L的 EDTA 配制 用 30mmol L的 EDTA 稀释 30倍即可 5mmol L的 MgCl2配制 称取 MgCl2 6H2O 的 101 5mg 溶于 100ml 的 Tris HCl pH7 0 即可 样品提取液的配制 200ml 取 10mmol L的 ASA 母液 20ml 10mmol L的母液 DTT20ml 取 30mmol L的 EDTA 母液 7ml 称取 203mg 的 MgCl2 6H2O 最后再量取 20ml 的甘油 将最终体积定容到 200ml 即可 可 溶 性 蛋 白 测 定 Bradford 法 样 品 反 应 体 系 800ul H2O 200ul Bradford 5ul样品 空白对照为 800ul H2O 200ul Bradford 测定后带入标准 曲线 Y 32 549X 0 224 Y代表蛋白含量 X 代表 OD595 计算得出蛋白含量 SOD 测定 SOD 活性的测定是根据照光时 体系中产生氧自由基使硝基四 唑蓝还原成蓝色甲 在 560nm 处有一吸收峰 而超氧化物歧化酶作为氧自由基 的清除剂可抑制此反应 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照 一半 50 时所需的酶量 14 5mmol L的 dl 甲硫氨酸 分子量 149 21 现用现配 称取甲硫氨酸 216 4mg 加少量 Tris HCl pH7 0溶解后 用 Tris HCl pH7 0定容到 100ml 即 可 30mmol L的 EDTA 292 25 现用现配 称取 EDTA 药品 876 75mg 加 少量 Tris HCl pH7 0溶解后 用 Tris HCl pH7 0定容到 100ml 即可 2 25mmol L的 NBT 硝基四唑蓝 817 6 现用现配 称取 NBT 药品 183 96mg 加少量 Tris HCl pH7 0溶解后 用 Tris HCl pH7 0定容到 100ml 即 可 60umol L的核黄素 376 36 现用现配 先称取 225 81mg 的核黄素 加少 量 50mM Tris HCl pH7 4溶解后 用 50mM Tris HCl pH7 4定容到 10ml 配制成 60mmol L的母液 然后取 100ul 到 100ml 的 Tris HCl pH7 4中 即可配制成 60umol L的核黄素 测酶活的反应介质 测定前在 54ml 的 14 5mmol L的 dl 甲硫氨酸中分别加 入 EDTA NBT 和核黄素各 2ml 此为反应混合液 酶活测定 在盛有 1 0ml 反应液的试管中 加入适量的酶液 50ul 以抑 制达 50 作用酶浓度为最佳 混匀后放在透明的试管架上 于光照培养箱中准 确照光 10min 后 迅速测定 560nm 处的光密度 以不加酶液照光液的为对照 计算反应被抑制的百分比 按下式计算超氧化物歧化酶的活性 A N 酶活力 AO W T V 50 式中 酶活力单位为每 min 每g鲜重酶活单位数 AO为对照试管溶液在 560nm 处的吸光度值 A 为对照试管溶液在 560nm 处的吸光值与加入酶液的反应液在 560nm 处 的吸光值的差 N为酶液总体积 W 为提取酶液的样品鲜重 g T 为照光时间 10min V 为加入酶液的体积 ml POD 测定 愈创木酚法 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中 在有过氧化氢存在下 过氧化物酶能使愈创木酚氧化 生成茶褐色物质 可用分 光光度计测量生成物的含量 反应混合液配制 在 50ml 的 50mmol L的 Tris HCl pH7 0缓冲液中加入 28ul 的愈创木酚 与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解 再加入 19ul 的 30 的 H2O2 混合均匀 4 保存 酶活测定 取反应混合液 1 0ml 加入 0 1ml 酶提取液 2min 前后 于 470nm 处测 OD 值 每隔 1min 读数一次 以每分钟 OD 值的变化表示酶活大小 测量 时再加入酶液 CAT 测定 H2O2法 反应缓冲液 20mM 的 H2O2 使用前在 25 水浴中加热 30min 酶活测定 取反应液 1 4ml 加入 100ul 酶液 每加完一管立即计时 并迅 速在波长 240nm 下测定 30S 1min30S 2min30S 时的吸光度 以 Tris HCl 的 作为空白 以 1min 内 A240减少 0 1的酶量为 1个酶活单位 代入酶活力公式 以 OD V 0 1 v t FW表示 CAT 活性 所有测定均重复三次 OD 代表 空 白的吸光度 样品管的吸光度 V 代表酶提取液的总体积 v 代表测量是加入的样 品体积 t 代表反应时间 min FW 代表样品鲜重 0 1mol LH2O2 配方 称取 1 1333g 的 30 的 H2O2 加入 100ml 的 50mmol L的 Tris HCl pH7 4 即可 也可以用 0 01 的 H2O2 4 叶绿素