医学分子生物学

DNA 复制 DNA 复制是指 DNA 双链在细胞分裂以前进行的复制过程 复制的 结果是一条双链变成两条一样的双链 如果复制过程正常的话 每条双链都 与原来的双链一样 这个过程是通过名为半保留复制的机制来得以顺利完成的 复制可以分为以下几个阶段 一 DNA 复制的引发 复制的引发 Priming 阶段包括 DNA 复制起点双链解开 通过转录激活步骤 合成 RNA 分子 RNA 引物的合成 DNA 聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物 RNA 的 3 OH 末端复制引发的关键步骤就是前导链 DNA 的合成 一旦前导链 DNA 的聚合作用开始 滞后链上的 DNA 合成也随着开始 在所有前导链开始 聚合之前有一必需的步骤就是由 RNA 聚合酶 不是引物酶 沿滞后链模板转录一 短的 RNA 分子 在有些 DNA 复制中 如质粒 ColE 该 RNA 分子经过加式 成为 DNA 复制的引物 但是 在大部分 DNA 复制中 该 RNA 分子没有引物 作用 它的作用似乎只是分开两条 DNA 链 暴露出某些特定序列以便引发体 与之结合 在前导链模板 DNA 上开始合成 RNA 引物 这个过程称为转录激活 transcriptional activation 在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质 如大肠杆菌的 dnaA 蛋白 这两种蛋白质可以和复制起点处 DNA 上高度保守的 4 个 9bp 长的序列结合 其具体功能尚不清楚 可能是这些蛋白质与 DNA 复制 起点结合后能促进 DNA 聚合酶 复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有 功能的全酶 DNA 复制开始时 DNA 螺旋酶首先在复制起点处将双链 DNA 解 开 通过转录激活合成的 RNA 分子也起分离两条 DNA 链的作用 然后单链 DNA 结合蛋白质结合在被解开的链上 由复制因子 X n 蛋白 复制因子 Y n 蛋白 n 蛋白 i 蛋白 dnaB 蛋白和 dnaC 蛋白等 6 种蛋白质组成的引发前体 preprimosome 在单链 DNA 结合蛋白的作用下与单链 DNA 结合生成中间物 这是一种前引发过程 引发前体进一步与引物酶 primase 组装成引发体 primosome 引发体可以在单链 DNA 上移动 在 dnaB 亚基的作用下识别 DNA 复制起点位置 首先在前导链上由引物酶催化合成一段 RNA 引物 然后 引发体在滞后链上沿 5 3 方向不停的移动 这是一种相对移动 也可能是滞后 链模板在移动 见后 在一定距离上反复合成 RNA 引物供 DNA 聚合酶 合成 冈崎片段使用 引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚 但是 这些成份必须 协同工作才能使引发体在滞后链上移动 识别合适的引物合成位置 并将核苷 酸在引发位置上聚合成 RNA 引物 由于引发体在滞后链模板上的移动方向与 其合成引物的方向相反 所以在滞后链上所合成的 RNA 引物非常短 一般只 有 3 5 个核苷酸长 而且 在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列 表明引物酶要在 DNA 滞后链模板上比较特定的位置 序列 上才能合成 RNA 引 物 为什么需要有 RNA 引物来引发 DNA 复制呢 这可能尽量减少 DNA 复制起始 处的突变有关 DNA 复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错 因此 用 RNA 引物即使出现差错最后也要被 DNA 聚合酶 切除 提高了 DNA 复制的准 确性 RNA 引物形成后 由 DNA 聚合酶 催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互 补原则加在 RNA 引物 3 OH 端而进入 DNA 链的延伸阶段 二 DNA 链的延伸 DNA 新生链的合成由 DNA 聚合酶 所催化 然而 DNA 必须由螺旋酶在复 制叉处边移动边解开双链 这样就产生了一种拓扑学上的问题 由于 DNA 的解 链 在 DNA 双链区势必产生正超螺旋 在环状 DNA 中更为明显 当达到一定 程度后就会造成复制叉难再继续前进 从而终止 DNA 复制 但是 在细胞内 DNA 复制不会因出现拓扑学问题而停止 有两种机制可以防止这种现象发生 1 DNA 在生物细胞中本身就是超螺旋 当 DNA 解链而产生正超螺旋时 可以被 原来存在的负超螺旋所中和 2 DNA 拓扑异构酶 要以打开一条链 使正超螺 旋状态转变成松弛状态 而 DNA 拓扑异构酶 旋转酶 可以在 DNA 解链前方 不停地继续将负超螺旋引入双链 DNA 这两种机制保证了无论是环状 DNA 还 是开环 DNA 的复制顺利的解链 再由 DNA 聚合酶 合成新的 DNA 链 前已 述及 DNA 生长链的延伸主要由 DNA 聚合酶催化 该酶是由 7 种蛋白质 多肽 组成的聚合体 称为全酶 全酶中所有亚基对完成 DNA 复制都是必需的 亚 基具有聚合功能和 5 3 外切酶活性 亚基具有 3 5 外切酶活性 另外 全 酶中还有 ATP 分子它是 DNA 聚合酶 催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在 RNA 引物上所必需的 其他亚基的功能尚不清楚 在 DNA 复制叉处要能由两套 DNA 聚合酶 在同一时间分别进行复制 DNA 前导链和滞后链 如果滞后链模板环绕 DNA 聚合酶 全酶 并通过 DNA 聚合 酶 然后再折向与未解链的双链 DNA 在同一方向上 则滞后链的合成可以 和前导链的合成在同一方向上进行 这样 当 DNA 聚合酶 沿着滞后链模板移动时 由特异的引物酶催化合成 的 RNA 引物即可以由 DNA 聚合酶 所延伸 当合成的 DNA 链到达前一次合 成的冈崎片段的位置时 滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从 DNA 聚合酶 上释放出来 这时 由于复制叉继续向前运动 便产生了又一段单链的滞后链 模板 它重新环绕 DNA 聚合酶 全酶 并通过 DNA 聚合酶 开始合成新的滞 后链冈崎片段 通过这样的机制 前导链的合成不会超过滞后链太多 最后只有 一个冈崎片段的长度 而且 这样引发体在 DNA 链上和 DNA 聚合酶 以同一 速度移动 按上述 DNA 复制的机制 在复制叉附近 形成了以两套 DNA 聚合酶 全酶 分子 引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体 称为 DNA 复制体 replisome 复制体在 DNA 前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续 的 DNA 前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链 在 DNA 合成延伸过程中主要 是 DNA 聚合酶 的作用 当冈崎片段形成后 DNA 聚合酶 通过其 5 3 外 切酶活性切除冈崎片段上的 RNA 引物 同时 利用后一个冈崎片段作为引物 由 5 3 合成 DNA 最后两个冈崎片段由 DNA 连接酶将其接起来 形成完整 的 DNA 滞后链 三 DNA 复制的终止 过去认为 DNA 一旦复制开始 就会将该 DNA 分子全部复制完毕 才终止 其 DNA 复制 但最近的实验表明 在 DNA 上也存在着复制终止位点 DNA 复 制将在复制终止位点处终止 并不一定等全部 DNA 合成完毕 但目前对复制 终止位点的结构和功能了解甚少在 NDA 复制终止阶段令人困惑的一个问题是 线性 DNA 分子两端是如何完成其复制的 已知 DNA 复制都要有 RNA 引物参与 当 RNA 引物被切除后 中间所遗留的间隙由 DNA 聚合 所填充 但是 在线 性分子的两端以 5 3 为模板的滞后链的合成 其末端的 RNA 引物被切除后是 无法被 DNA 聚合酶所填充的 在研究 T7DNA 复制时 这个问题部分地得到了解决 T7DNA 两端的 DNA 序列区有 160bp 长的序列完全相同 而且 在 T7DNA 复制时 产生的子代 DNA 分子不是一个单位 T7DNA 长度 而是许多单位长度的 T7DNA 首尾连接 在一起 T7DNA 两个子代 DNA 分子都会有一个 3 端单链尾巴 两个子代 DNA 的 3 端尾巴以互补结合形成两个单位 T7DNA 的线性连接 然后由 DNA 聚合酶 填充和 DNA 连接酶连接后 继续复制便形成四个单位长度的 T7DNA 分子 这样复制下去 便可形成多个单位长度的 T7DNA 分子 这样的 T7DNA 分子可 以被特异的内切酶切开 用 DNA 聚合酶填充与亲代 DNA 完全一样的双链 T7DNA 分子 在研究痘病毒复制时 发现了线性 DNA 分子完成末端复制的第二种方式 痘病毒 DNA 在两端都形成发夹环状结构 DNA 复制时 在线性分子中间的一 个复制起点开始 双向进行 将发夹环状结构变成双链环状 DNA 然后 在发 夹的中央将不同 DNA 链切开 使 DNA 分子变性 双链分开 这样 在每个分 子两端形成一个单链尾端要以自我互补 形成完整的发夹结构 与亲代 DNA 分子一样 在真核生物染色体线性 DNA 分子复制时 尚不清楚末端的复制过 程是怎样进行的 也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制 但最近的实 验表明 真核生物染色体末端 DNA 复制是由一种特殊的酶将一个新的末端 DNA 序列加在刚刚完成复制的 DNA 末端 这种机制首先在四膜虫中发现 该 生物细胞的线性 DNA 分子末端有 30 70 拷贝的 5 TTGGGG3 序列 该细胞中 存在一种酶可以将 TTGGGG 序列加在事先已存在的单键 DNA 末端的 TTGGGG 序列上 这样有较长的末端单链 DNA 可以被引物酶重新引发或其 他的酶蛋白引发而合成 RNA 引物 并由 DNA 聚合酶将其变成双链 DNA 这样 就可以避免其 DNA 随着复制的不断进行而逐渐变短 在环状 DNA 的复制的末端终止阶段则不存在上述问题 环状 DNA 复制到最 后 由 DNA 拓扑异构酶 切开双链 DNA 将两个 DNA 分子分开成为两个完整 的与亲代 DNA 分子一样的子代 DNA 高中生物范畴下的 DNA 复制 DNA 的复制是一个边解旋边复制的过程 复制开始时 DNA 分子首先利用 细胞提供的能量 在解旋酶的作用下 把两条螺旋的双链解开 这个过程叫解 旋 然后 以解开的每一段母链为模板 以周围环境中的四种脱氧核苷酸为原 料 按照碱基配对互补配对原则 在 DNA 聚合酶的作用下 各自合成与母链 互补的一段子链 随着解旋过程的进行 新合成的子链也不断地延伸 同时 每条子链与其母链盘绕成双螺旋结构 从而各形成一个新的 DNA 分子 这样 复制结束后 一个 DNA 分子 通过细胞分裂分配到两个子细胞中去 以原核生物 DNA 复制过程予以简要说明 1 DNA 双螺旋的解旋 DNA 在复制时 其双链首先解开 形成复制叉 而复制叉的形成则是由多种蛋 白质及酶参与的较复杂的复制过程 1 单链 DNA 结合蛋白 single stranded DNA binding protein ssbDNA 蛋白 ssbDNA 蛋白是较牢固的 结合在单链 DNA 上的蛋白质 原核生物 ssbDNA 蛋白与 DNA 结合时表现出协 同效应 若第 1 个 ssbDNA 蛋白结合到 DNA 上去能力为 1 第 2 个的结合能 力可高达 103 真核生物细胞中的 ssbDNA 蛋白与单链 DNA 结合时则不表现 上述效应 ssbDNA 蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持 单链结构 它以四聚体的形式存在于复制叉处 待单链复制后才脱下来 重新 循环 所以 ssbDNA 蛋白只保持单链的存在 不起解旋作用 2 DNA 解 链酶 DNA helicase DNA 解链酶能通过水解 ATP 获得能量以解开双链 DNA 这种解链酶分解 ATP 的活性依赖于单链 DNA 的存在 如果双链 DNA 中有单链末端或切口 则 DNA 解链酶可以首先结合在这一部分 然后逐步向 双链方向移动 复制时 大部分 DNA 解旋酶可沿滞后模板的 5 3 方向并随 着复制叉的前进而移动 只有个别解旋酶 Rep 蛋白 是沿着 3 5 方向移 动的 故推测 Rep 蛋白和特定 DNA 解链酶是分别在 DNA 的两条母链上协同作 用以解开双链 DNA 3 DNA 解链过程 DNA 在复制前不仅是双螺旋而且处 于超螺旋状态 而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态 参与解链的除 解链酶外还有一些特定蛋白质 如大肠杆菌中的 Dna 蛋白等 一旦 DNA 局部 双链解开 就必须有 ssbDNA 蛋白以稳定解开的单链 保证此局部不会恢复成 双链 两条单链 DNA 复制的引发过程有所差异 但是不论是前导链还是后随 链 都需要一段 RNA 引物用于开始子链 DNA 的合成 因此前导链与后随链的 差别在于前者从复制起始点开始按 5 3 持续的合成下去 不形成冈崎片段 后者则随着复制叉的出现 不断合成长约 2 3kb 的冈崎片段 2 冈崎 片段与半不连续复制 因 DNA 的两条链是反向平行的 故在复制叉附近解 开的 DNA 链 一条是 5 3 方向 另一条是 3 5 方向 两个模板极性不 同 所有已知 DNA 聚合酶合成方向均是 5 3 方向 不是 3 5 方向 因 而无法解释 DNA 的两条链同时进行复制的问题 为解释 DNA 两条链各自模板 合成子链等速复制现象 日本学者冈崎 Okazaki 等人提出了 DNA 的半连续 复制 semidiscontinuous replication 模型 1968 年冈崎用 3H 脱氧胸苷短时 间标记大肠杆菌 提取 DNA 变性后用超离心方法得到了许多 3H 标记的 被 后人称作冈崎片段的 DNA 延长标记时间后 冈崎片段可转变为成熟 DNA 链 因此这些片段必然是复制过程中的中间产物 另一个实验也证明 DNA 复制过 程中首先合成较小的片段 即用 DNA 连接酶温度敏感突变株进行试验 在连 接酶不起作用的温度下 便有大量小 DNA 片段积累 表明 DNA 复制过程中至 少有一条链首先合成较短的片段 然后再由连接酶链成大分子 DNA 一般说 原核生物的冈崎片段比真核生物的长 深入研究还证明 前导链的连续复制和 滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性 故称为 DNA 双螺旋的半不连续复 制 3 复制的引发和终止 所有的 DNA 的复制都是从一个固定的起 始点开始的 而 DNA 聚合酶只能延长已存在的 DNA 链 不能从头合成 DNA 链 新 DNA 的复制是如何形成的 经大量实验研究证明 DNA 复制时 往往 先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物 再由聚合酶从 RNA 引物 3 端开始合成新的 DNA 链 对于前导链来说 这一引发过程比较简单 只要有 一段 RNA 引物 DNA 聚合酶就能以此为起点 一直合成下去 对于后随链 引发过程较为复杂 需要多种蛋白质和酶参与 后随链的引发过程由引发体来 完成 引发体由 6 种蛋白质构成 预引体或引体前体把这 6 种蛋白质结合在一 起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体 引发体似火车头一样在后 随链分叉的方向前进 并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物 RNA 短 链 再由 DNA 聚合酶 III 作用合成 DNA 直至遇到下一个引物或冈崎片段为 止 由 RNA 酶 H 降解 RNA 引物并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐 再由 DNA 连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子 DNA dna 转录转录 翻译的具体过程翻译的具体过程 原始转录产物的合成 启动 RNA 聚合酶正确识别 DNA 模板上的启动子并形成由酶 DNA 和核苷三磷酸 NTP 构成的三元起始复合物 转录即自此开始 DNA 模板上的启动区域常 含有 TATAATG 顺序 称普里布诺 Pribnow 盒或 P 盒 复合物中的核苷三 磷酸一般为 GTP 少数为 ATP 因而原始转录产物的 5 端通常为三磷酸鸟苷 pppG 或腺苷三磷酸 pppA 真核 DNA 上的转录启动区域也有类似原核 DNA 的启动区结构 和在 30bp 即在酶和 DNA 结合点的上游 30 核苷酸处 常以 30 表示 bp 为碱基对的简写 附近也含有 TATA 结构 称霍格内斯 Hogness 盒或 TATA 盒 第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成 3 5 磷酸二酯键后 则启动阶段结束 进入延伸阶段 延伸 亚基脱离酶分子 留下的核心酶与 DNA 的结合变松 因而较容易继续往前 移动 核心酶无模板专一性 能转录模板上的任何顺序 包括在转录后加工时 待切除的居间顺序 脱离核心酶的 亚基还可与另外的核心酶结合 参与另一 转录过程 随着转录不断延伸 DNA 双链顺次地被打开 并接受新来的碱基配 对 合成新的磷酸二酯键后 核心酶向前移去 已使用过的模板重新关闭起来 恢复原来的双链结构 一般合成的 RNA 链对 DNA 模板具有高度的忠实性 RNA 合成的速度 原核为 25 50 个核苷酸 秒 真核为 45 100 个核苷酸 秒 终止 转录的终止包括停止延伸及释放 RNA 聚合酶和合成的 RNA 在原核生物基 因或操纵子的末端通常有一段终止序列即终止子 RNA 合成就在这里终止 原 核细胞转录终止需要一种终止因子 四个亚基构成的蛋白质 的帮助 真核 生物 DNA 上也可能有转录终止的信号 已知真核 DNA 转录单元的 3 端均含富 有 AT 的序列 如 AATAA A 或 ATTAA A 等 在相隔 0 30bp 之后又出现 TTTT 顺序 通常是 3 5 个 T 这些结构可能与转录终止或者与 3 端添加多 聚 A 顺序有关 转录产物的后加工 mRNA 前体的后加工 原核 mRNA 的原始转录产物 除个别噬菌体外 都可直接用于翻译 而真核 mRNA 一般都有相应的前体 前体必须经过后加工才能用于转译蛋白质 一般 认为 真核 mRNA 的原始转录产物 也称原始转录前体 hn RNA hetero geneous nuclear RNA 核不均一 RNA 最终被加工成成熟的 mRNA mRNA 前体的后加工包括以下四方面 装上 5 端帽子 转录产物的 5 端通常 要装上甲基化的帽子 有的转录产物 5 端有多余的顺序 则需切除后再装上帽 子 装上 3 端多聚 A 尾巴 转录产物的 3 端通常由多聚 A 聚合酶催化加上一 段多聚 A 多聚 A 尾巴的平均长度在 20 200 个核苷酸 有的转录产物的 3 端 有多余顺序 则需切除后再加上尾巴 装 5 端帽子和 3 端尾巴均可能在剪接之 前就已完成 剪接 将 mRNA 前体上的居间顺序切除 再将被隔开的蛋白质 编码区连接起来 剪接过程是由细胞核小分子 RNA 如 U1RNA 参与完成的 被切除的居间顺序形成套索形 即 lariat RNA 中间体 修饰 mRNA 分子 内的某些部位常存在 N6 甲基腺苷 它是由甲基化酶催化产生的 也是在转录 后加工时修饰的 有的真核 mRNA 前体 由于后加工的不同可产生两种或 两种以上的 mRNA 如人的降血钙素基因转录产物 因而能翻译成两种或两 种以上的多肽链 tRNA 前体的后加工 目前分离得到的 tRNA 前体有两类 含单个 tRNA 的 tRNA 前体 在 5 端 和 3 端各有一段多余顺序 含二个 tRNA 的 tRNA 前体 除 5 端和 3 端有长 短不一的多余顺序