酶的种类,活性及影响因素

酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究和影响酶的活性,【摘要】：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH值，抑制剂对于酶活性的影响。 【关键词】：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH，温度，抑制剂,【酶的特性综述】 酶是一种具有生物活性的蛋白质，有单纯酶和结合酶两种。单纯酶只含蛋白质，不含其它物质，其催化活性仅由蛋白质的结构决定。结合酶则由单纯蛋白质和辅基组成，辅基是结合酶催化活性中不可缺少的部分。 (1)酶的催化效力远远超过化学催化剂(高108109倍)。(2)酶催化剂具有高效化学选择性，能从混合物中选择特定异构体进行催化反应。(3)酶催化剂对反应条件要求苛刻，如pH值、温度都各有特定的界限，超出界限即可引起酶蛋白的变性与分解。,酪氨酸酶简介,酪氨酸酶是一种多酚氧化酶,具有广泛用途。它主要存在于动植物体中,在它的催化作用下经过一系列的生化反应生成色素。缺乏此酶将导致代谢性病变：白化病；相反，如果该酶活力过高，又可形成黑色素瘤，最近人们还研究发现酪氨酸酶可能还与白癜风发病机制有关。因此研究酪氨酸酶不仅有理论意义，而且还有一定的应用价值。,实验原理,酪氨酸是一种以Cu+ 或Cu2+ 为辅助因子的全酶，能催化空气中的氧对多巴的氧化反应，催化过程可以通过多巴转换反应的颜色变化来监测，通过测定吸光度随时间的变化来求的酶的活性。,实验原理,25时在 1min内转化1 mol底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：a=A*10-6/ktV式中：a为所用溶液的酶的活性，A为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，k为酪氨酸的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。进而计算出所用原料中的酶的活性：A=aV0/m 式中：a为原料中酶的活性，V0为原料所得的酶溶液的总体积（9ml），m为原料总质量（10.0g）,实验试剂与仪器,实验步骤,酪氨酸酶的提取 在研钵中放入10.0g切碎的马铃薯,加入7.5mlpH值7.2的缓冲溶液,研磨挤压。滤出提取液,离心分离。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。 酶活性的测定 取2.5ml上述提取液,用pH值7.2的缓冲溶液于10.0ml比色管中稀释至刻度,摇匀。取0.1ml稀释过的提取液于10.0ml比色管中,加入2.9mlpH值6.0的缓冲溶液,再加入2.0ml多巴溶液,用分光光 度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读1个数,以后隔2min读1个数,直至吸光度变化不大为止,得吸光度为A1。取0.2,0.3,0.4ml已稀释过的提取液重复上述试验,得吸光度分别为A2、A3、A4。,实验结果记录,表1：不同酶加入量不同时间反应的吸光度测定,以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下多巴的转换动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即为酶的活性。为使作图更为准确，现只取前六分钟内数据作图如下：,实验数据处理与结果分析,图1:0.10mol提取液关系曲线 图2:0.20mol提取液关系曲线,图3:0.30mol提取液关系曲线 图4:0.40mol提取液关系曲线,实验数据处理与结果分析,根据实验数据所画图及求出的活度来看，分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml的活性是不一样，按照实验推测，应该是逐渐上升的，但是从实验结果反应的情况上来看，并不是如此，而是上升之后下降，原因在于酶提取液提取之后保存方法不得当，并没有冰浴，所以导致酶失活，从而导致活性下降的情况,依次得出不同提取液的活性，比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴转换速率。由于放置时间较长，第四组实验已经失去可靠性。（酪氨酸酶的吸光系数为lg k=3.7。）表2：酶的活性计算,酶活性影响因素的研究,取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。取0.40ml稀释过的提取液，加入少量的固体Na2S2O3配成测定溶液，观察现象。取0.40ml稀释过的提取液，加少量EDTA振动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。,数据记录,实验结果讨论,（1）在沸水浴中加热5分钟冷却后测得的溶液吸光度基本保持不变，其酶的活性在高温下失活。（2）加入少量固体Na2S2O3配成的测定溶液，其测得的吸光度也基本保持不变且比（1）条件下的吸光度还小，其原因是硫代硫酸钠是还原剂， 使蛋白质变性。（3）稀释的提取液加入少量EDTA振动混合，其测得的吸光度在缓慢减小。其原因是EDTA与辅助因子络合，使酶活性失活。,影响酶活性的因素,影响酶活性的因素,实验现象证明，唾液淀粉酶活性有效,实验一 淀粉酶活性的检测,影响酶活性的因素,实验二 pH对酶活性的影响,1.pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活.2.pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适pH。唾液淀粉酶的最适PH为中性，故在蒸馏水中沉淀最多，盐酸酸性过强，使酶的活性失活，乳酸是弱酸，颜色基本不变，碳酸钠是弱碱，产生较少的沉淀。,酶活性的影响因素,实验三 温度对酶活性的影响,酶的催化作用受温度的影响很大，酶的化学本质是蛋白质，所以温度过高会引起蛋白质变性导致酶的失活，唾液淀粉酶在70和0时，酶活性失活，颜色呈蓝色。在37时，是唾液淀粉酶的最适温度，淀粉遇唾液淀粉酶水解，颜色呈浅黄色。,影响酶活性的因素,实验四 抑制剂与激活剂对酶活性的影响,酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很多少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。本实验中氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。所以加入NaCl后，溶液颜色为浅黄色。氯离子促进唾液淀粉酶的水解。铜离子作为抑制剂，故加入硫酸铜后，溶液颜色为深蓝色。水作为对照变量，加入后对溶液稀释，颜色为浅蓝色。,结论（1）酶是一种活性蛋白质，因此，一切对蛋白质有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。（2）提取物在放置过程中变黑，是由于他们的组织中都含酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于组织内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。（3）酶的催化作用，只有在一定温度下才能体现出来。酶在低温下活性暂时被抑制，高温时会永久失活。,参考文献： 1 KenllnerR,MermetJM,OttoMWindmerHM.Analytical Chemistry.Chapter6.Weiheim:Wiley VCH，1998;北京大学、吉林大学合译分析化学北京:北京大学出版社，2000第6章 2 王希成编生物化学（第3版