《基因克隆的策略》PPT课件.ppt

基因工程概论 第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术 第四章基因克隆的策略 引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定 引言 基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达 而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的 一般而言 基因克隆包括四部分工作 1 目标DNA片段的获得 2 克隆载体的构建 3 寄主细胞的转化 4 重组体克隆的选择和鉴定 目前 以大肠杆菌为寄主 以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟 本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析 大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案 DNA片段的获得 载体构建 细菌转化 重组体的鉴定 限制性内切酶消化 机械切割 双链cDNA的合成 化学法直接合成 同聚物加尾 粘性末端连接 平末端连接 加接头造成粘性末端 重组噬菌体DNA转染 重组质粒的转化 体外包装进行转导 表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定 第四章基因克隆的策略 引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定 第一节目的DNA片段的获得 1 化学法直接合成基因2 从基因组文库中钓取目的基因3 从cDNA文库中钓取目的基因4 通过PCR直接扩增出目的基因 1 化学法直接合成基因 所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列 所以只要掌握了其分子结构 完全可以在实验室进行人工合成 1977年 K Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因 生长激素释放因子基因 并在大肠杆菌中实现了成功的表达 从此 化学合成基因得到了很大的发展迅速 早期通过化学合成的部分基因 基因人胰岛素转运RNA 干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素 干扰素 大小 bp 12654281162453 合成年代197819791981198219821984 基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶 大小 bp 105777170385324375 合成年代198519851985198519861987 磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成首先 将一个5 端保护了的核苷酸和另一个3 端保护了的核苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子 为了定向形成5 3 磷酸二酯键 通常用化学物质将不参加反应的基团保护起来 1 化学法直接合成基因 反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉 这样一个5 保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3 端保护了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子 如此反复进行缩合反应 就可以合成一条特定的寡核苷酸片段 基因的组装过程通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150 200bp的长度 而一个基因的长度通常要大的多 所以必须通过一定的程序将寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因 这种将多个寡核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装 基因组装常用的有两种方法 一种方法是先将寡核苷酸片段激活 带上5 磷酸基团 然后与相应的互补寡核苷酸片段退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段 最后通过连接酶将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因 第二种方法是将两条具有3 端互补的寡核苷酸单链进行退火 所产生的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段 以此类推便可得到合成的基因片段 1 化学法直接合成基因 基因的组装过程 1 化学法直接合成基因 方法1 第一节目的DNA片段的获得 1 化学法直接合成2 从基因组文库中钓取3 从cDNA文库中钓取4 通过PCR直接扩增 2 从基因组文库中钓取 基因文库 genelibrary 是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体 转化子群 基因组文库的大小 即应该包含多少个独立的克隆 与基因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关 基因组的大小 bp 2 106 细菌 2 107 真菌 3 109 动物 理论数实际数理论数实际数理论数实际数 克隆片段的平均大小 bp 5 10340018314000184186000002763110910 10320091920009208300000138155020 1031004581000460315000069077440 10350278500230075000354386 2 从基因组文库中钓取 因为基因组DNA片段是随即克隆的 所以基因组大小除以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值 从统计学的角度分析 从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有50 当克隆数增加到这一理论值的2倍时 克隆到特定DNA片段的几率就上升到75 所以为了达到一种合理的几率以克隆到目的基因 一个完整的基因组文库就必须含有3 10倍于最低重组克隆数的克隆 1975年 L Clarke和J Carbon提出了一个计算完全基因组文库所需实际克隆数的公式 N ln 1 p ln 1 f 其中 N代表实际克隆数 p代表在重组群体中出现特定基因的几率 一般的期望值都为99 f代表限制性片段的平均大小与相应生物体基因组大小的比值 2 从基因组文库中钓取目的基因 1981年Ish Horowics和Burke设计的特殊的基因组克隆方案 选用MboI或Sau3A进行基因组DNA的酶切 不仅是因为它们是4碱基识别位点的酶 而且它们和BamHI是同尾酶 cos HindIII BamHI SalI SalI HindIII 磷酸化酶 SalI BamHI BamHI HindIII BamHI BamHI SalI HindIII Sau3A 磷酸化酶 32 47kb 第一节目的基因的获得 1 化学法直接合成基因2 从基因组文库中钓取目的基因3 从cDNA文库中钓取目的基因4 通过PCR直接扩增出目的基因 3 从cDNA文库中钓取目的基因 从真核生物基因组文库中直接分离到目的基因十分困难 这主要是因为 真核生物的基因组太大 而其中非编码区占的比例很大 另外 真核基因大都有很大的内含子 很难从基因组文库中直接分离到目的基因 克隆真核生物的基因往往是从cDNA文库的建立开始的 主要步骤包括 总RNA的提取和纯化 cDNA的合成 cDNA文库的构建 A 文库的构建 3 从cDNA文库中钓取目的基因 3 AAAAAAAA 多聚T引物反转录酶 S1核酸酶 cDNA文库的构建过程 A 文库的构建 A 文库的构建 构建好文库后就需要从众多的克隆中筛选出含有目的DNA片段的克隆 这时一般要用到菌落原位杂交技术 如果两条同原性很高的DNA序列解链后混合 当条件恢复时来源于不同的DNA的单链间可以通过碱基互补而发生紧密结合 杂交 所以我们可以将某种已知的DNA序列制备成探针 Probe 即将DNA序列用同位素或地高辛标记 这样就可以同过探针的杂交来筛选出含有特定DNA序列的克隆 用同位素标记后可以通过X 光片的感光来探测到有杂交信号的克隆 用地高辛标记后可以通过结合在抗地高辛抗体上的碱性磷酸酶与显色底物的反应直接观察到发生了杂交的克隆 对应位置显为紫色 B 克隆的筛选 B 克隆的筛选 将克隆转移到一张硝酸纤维素膜或是尼龙膜上 用碱处理使的细胞中的DNA释放出来并且发生解链 然后通过烘烤或紫外线照射将DNA固定在膜上 菌落原位杂交的基本流程是 B 克隆的筛选 将转好的膜在含有探针的杂交液中杂交 使得探针与目标DNA紧密结合 漂洗后将非特异结合的探针去掉 探针为地高辛标记时 可以通过抗体和地高辛的二次杂交和显色反应在含有特定DNA片段的克隆对应位置出现紫色印记 如果探针为同位素标记时 可以通过放射自显影使得X 光片感光而在相应位置出现感光信号 C 目标DNA片段的获得 一般来说将筛选到的克隆提取其中质粒DNA 通过酶切就可以获得所要的目标DNA片段 但是 有时克隆到的片段还是比较大 为了进一步获得更精确的DNA片段 我们还要进一步的DNA杂交 比如 我们可以将克隆到的DNA片段用某一种或几中限制性内切酶消化 再通过电泳将不同分子的DNA分开 然后通过毛细管法将DNA从凝胶中转移到尼龙膜上 最后用探针杂交以确定含有特定片段的目的DNA片段 Oncealibraryhasbeenestablished itisneccessarytoidentifywhichclone s containthegeneofinterest Amoregenerallyusedscreeningmethodiscolonyhybridisation OligonucleotidessuchasoligoRNAandDNAmoleculeswillinteractthroughbase pairingiftheysharesignificantsequencehomology ThismeansthatapieceofDNAcanbesynthesisedwithasequencethatiscomplementarytothegeneofinterestandlabelledinsomeway Thisisusuallydonebyradiolabeling althoughnon radioactivemethodsareincreasinginpopularity Thelabelingsystemwewilluseinthepracticalsessionswillbethe Dig system Thisusesadigoxygenin labelednucleotideincorporatedintoDNAbynick translation Thedig labeledoligonucleotideisdetectedbyananti digantibodythatisconjugatedtotheenzymealkalinephosphatase Thisenzymecatalysesareactionwithacolorimetricsubstrateandresultsinproductionofapurplecolour B 克隆的筛选 B 克隆的筛选 a Coloniesareplacedonanitrocelluloseornylonmembrane Thiscanbedonebyspottingsamplesorbytransferfromagarplates dependingonhowthelibraryisstored b CellsaredegradedtoliberateDNAwhichisthendenaturedandfixedtothemembrane Theprocedureforcolonyhybridisationisasfollows B 克隆的筛选 c Themembraneisincubatedwiththelabeledoligobucleotideprobe Themembraneisthenwashedtoremoveanynon specificallyboundprobe d Specificbindingisthendetectedbyautoradiography X rayfilmislayedontopofthemembraneandsignalsdetectedafterdevelopingthefilm C 目标DNA片段的获得 Onceaclonehasbeenidentifiedinaclonelibrary furtheranalysescanthenbedonetoidentifythegeneofinterestwithintheclonedDNA AnimportantmeansofachievingthisisSouthernhybridisationoffragmentsgeneratedbyrestrictionenzymedigestion ThetechniqueinvolvesdigestionoftheDNAwithrestrictionenzymesandseparationofthefragmentsbyagarosegelelectrophoresis Thefragmentsarethentransferedtoamembranebyblotting Thefragmentscontainingthegeneofinterestarethendetectedbyincubatingthemembranewithalabeledprobefollowedbywashingandautoradiography 第一节目的基因的获得 1 化学法直接合成基因2 从基因组文库中钓取目的基因3 从cDNA文库中钓取目的基因4 通过PCR直接扩增出目的基因 4 通过PCR直接扩增出目的基因 如果已经知道了某一基因家族中某一成员的序列 则可以根据该家族基因的保守序列设计特异性引物直接从该生物基因组DNA中扩增获得该基因的特定区域 甚至是全基因 如果该基因很大是 可以分段进行克隆 然后再将获得的片段连接起来 最终得到目的基因的全序列 第四章基因克隆的策略 引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定 第二节重组体的构建及细菌转化 1 载体的选择和分离2 目的基因与载体的连接3 重组体向寄主细胞的导入 1 载体的选择和分离 SelectionofvectorThechoiceofvectorwilldependtoalargedegreeonwhatthedesiredoutcomeofthegenecloningexperimentis Manytimes avectorisneededtosub cloneafragmentfromagenelibrary ThepUCseriesandpGEMseriesareexamplesofgoodgeneral purposecloningvectors Ifthesequenceofthegeneistheobjectoftheexercise thenavectorwhichgivesrisetosingle strandedDNAisrequiredsuchasoneoftheM13series IfexpressionoftheproteinproductisneededthenavectoroptimizedforthispurposesuchasthepETseriesshouldbechosen 质粒DNA的分离方法很多 但其中共同的步骤是 用溶菌酶处理含有载体的寄主细胞培养物 以破坏细胞壁 加入SDS sodiumdodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 之类的去污剂使寄主细胞发生温和的溶菌作用 这时 细胞内的环状质粒DNA 多聚核糖体 可溶性蛋白质等生物大分子放出来 而核染色体仍然附着在细胞的碎片上 通过离心将细胞碎片及附着于其上的染色体DNA等物质去除 这时质粒DNA分布在上清液中 e 用酚 酚 氯仿 异戊醇处理去除上清液中的蛋白质 最终获得质粒 1 载体的选择和分离 第二节重组体的构建及细菌转化 1 载体的选择和分离2 目的片段与载体的连接3 重组体向寄主细胞的导入 2 目的基因与载体的连接 GenerationofrecombinantmoleculesInordertogeneratearecombinantmolecule bothvectorandsourceDNAshuoldbecutwithcompatiblerestrictionenzymes Thatistosaytheendsliberatedbytheenzymesshouldbemutuallycohesive Thisisachievedbyusingoneenzymeorbycuttingthetwomoleculeswithtwoenzymesthatliberatethesamecohesiveends suchasBamHIandSau3A AfterdigestionofbothDNAandvector themoleculesaremixedandligatedusingDNAligase Thisisbestachievedwithoverlappingcohesiveends butcanoccurusingbluntends albeit l bi t withmuchlowerefficiency 互补粘性末端分子间的连接用同一可产生粘性末端的限制性内切酶去切割外源DNA分子和载体时 所产生的粘末端DNA分子间很容易进行连接 当然 通过同尾酶切割后的DNA片段也具有这种特性 除了尽量选用粘性末端连接外 构建载体还应注意 实验步骤要尽量简单易行 并设法提高连接的效率 如防止载体的自连 连接到载体上的外源片段应该能重新切割下来 以便于回收克隆的DNA片段 如果是要求实现基因表达的序列 还要注意转录和翻译的密码子结构的正确性 要注意插入片段的方向性 2 目的基因与载体的连接 载体去磷防止连接反应中的载体自连 P OH P OH OH OH OH OH P OH P OH OH OH OH OH 连接酶 连接酶 连接酶 碱性磷酸酶 2Pi 寄主修复缺口 载体自连或产生二具体等 2 目的基因与载体的连接 外源DNA片段的定向插入当两个末端具有相同得粘性末端的DNA分子或是平末端的DNA分子插入到载体中时 会出现正向和反向插入两种情况 一方面 我们可以通过对重组质粒的酶切鉴定来选择正向插入的克隆或反向插入的克隆 另一方面 通过选用两种合适的限制性内切酶分别对载体和外源DNA进行切割也可以实现外源DNA分子的定向插入 2 目的基因与载体的连接 HindIII BamHI HindIII BamHI HindIII BamHI 平末端DNA片段加接头 在实际操作中 往往会出现找不到合适酶切位点 或是所产生的外源DNA只能是平末端的情况 这时就需要对平末端的DNA分子进行连接 对于这种连接实验 我们可以采用加接头法 也可以采用末端转移酶加尾法 当然用平末端直接连接也是可以的 只是连接效率要低得多 CCGAATTCGGGGCTTAAGCC 磷酸化 CCGAATTCGGGGCTTAAGCC P OH OH P P P OH OH T4连接酶 CCGAATTCGGGGCTTAAGCC P OH P OH EcoRI CCGAATTCGGGGCTTAAGCC AATTCGGGCC CCGGGCTTAA 2 目的基因与载体的连接 3 3 5 5 3 3 5 5 DNA聚合酶和T4DNA连接酶 平末端DNA片段末端加尾法连接 2 目的基因与载体的连接 第二节重组载体的构建及细菌转化 1 载体的选择和分离2 目的基因与载体的连接3 重组载体向寄主细胞的导入 3 重组载体向寄主细胞的导入 重组DNA分子构建好后必须转移到适当的受体细胞中才能得到扩增和表达 将普通的质粒分子导入受体细胞的过程称为转化 tranformation 将具有感染能力的噬菌体DNA分子导入受体细胞的过程称为转染 transfection 而噬菌体主动将其DNA注入受体细胞得过程称为感染 infection 1970年 Mandel和Higa等发现 用CaCl2溶液处理过的大肠杆菌细胞比较容易获得 噬菌体的DNA 1972年 Cohen等也发现用CaCl2溶液处理过的大肠杆菌能被环状的质粒DNA分子所转化 这种经过处理能够接受外源DNA的细胞成为感受态细胞 copetentcell 3 重组体向寄主细胞的导入 大肠杆菌感受态细胞的制备 在不含抗生素的LB平板上涂布大肠杆菌DH5 于37 培养过夜 16 20h 挑一个单菌落接种于25mL无菌的LB培养液中 37 中速震荡培养3h 将上述菌液在冰浴5分钟 然后在4 4000rpm离心10分钟 将细菌沉淀用5mL预冷的CaCl2 0 1M 重悬 冰浴一会后于4 4000rpm离心10分钟 将细菌沉淀用1mL预冷的CaCl2 0 1M 重悬 取200uL用于细菌转化 其余菌液加入20 的无菌甘油 摇匀后于 20 保存备用 质粒DNA转化大肠杆菌的程序 3 重组体向寄主细胞的导入 用冷的无菌枪头吸取200uL感受态细胞到一新的离心管中 加入质粒DNA后冰浴30分钟 立即将转化用的离心管置入42 水浴中静置90秒 迅速将离心管移入冰水混合物中冰浴1 2分钟 加入800uL的LB培养基 混匀后于37 水浴5分钟 将离心管侧向固定在摇床上 37 缓慢震荡培养45分钟 于室温1000rpm离心5分钟 弃取约800uL的培养液 再将剩余的培养液和细菌重悬 然后涂布到含有抗生素的LB平板上37 选择培养过夜 16h 检测选择平板上的抗性菌落 并提取质粒DNA进行鉴定 第四章基因克隆的策略 引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定 第三节重组克隆的筛选和鉴定 根据所使用克隆载体的特性不同 重组克隆的筛选方法也多种多样 比如 用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选 所有正常的噬菌斑都是重组体 当使用pUC系列载体时 白色菌落一般都是重组体 如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性 那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定 比如 从平板上随机挑选10个菌落 然后提取其中的质粒DNA分子 并对其进行酶切分析 同样可以准确地选择得到所要的重组克隆 而且同时可以鉴定外源片段插入的方向 选择得到所要的理想克隆 有时 我们不仅想知道哪些是重组体克隆 而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆 比如在cDNA文库的筛选中 我们就需要选择到含有目的基因克隆 这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法 随机挑取提取质粒 第三节重组克隆的筛选和鉴定 连接产物转化 空载体转化 酶切质粒 1 0 0 5 3 5kb 1234567891011M 1 0 0 5 0 5 1 0 4 0 3 0 5 0 A A 第三节重组克隆的筛选和鉴定 第四章基因克隆的策略 引言第一节目的基因的获得第二节重组载体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定 第一节目的基因的获得 1 化学法直接合成基因2 从基因组文库中钓取目的基因3 从cDNA文库中钓取目的基因4 通过PCR直接扩增出目的基因 第二节重组体的构建及细菌转化 1 载体的选择和分离2 目的基因与载体的连接3 重组体向寄主细胞的导入 大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案 DNA片段的获得 载体构建 细菌转化 重组体的鉴定 限制性内切酶消化 机械切割 双链cDNA的合成 化学法直接合成 同聚物加尾 粘性末端连接 平末端连接 加接头造成粘性末端 重组噬菌体DNA转染 重组质粒的转化 体外包装进行转导 表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定 基因工程的基本步骤 基因分离酶切 载体酶切 基因和载体连接 导入细菌 重组质粒繁殖 重组克隆的选择 序列分析和基因表达等研究 唙坂宩冈黊毝趥橳靜濬竲磟婀簽膌騛惄蔅硋震襈教腡鴊祽傽夃獅暬搣傿展娯鴀畒瑖罃錟氺瓭達起媛芩齄濦駺皚姧喇豷苝鹢鰴搲卟孙氭爃纋袝禒袆衊賤湆梒筽異趫鎴屫捝跭呇勔廾澝儀雏鄿瓀氰紧鲋褂陊盟傮憛渪兹猖哦踖橛欛岃櫽榌禫牸涋鷳荈彲鶋輵蚵鉚嚨苐蒮缮麲衱簛鑞脞辡窧烏茎釣瀓庻渳羍枣嗚悃銵葋塽堥濵淶鍴県霐歷鵮昏旽啞拷撡喤蜐莛茗睠圦蟬钟鼏短屢蝃俵刃騔纸嘻趪嚯恄併阶瓍栂泳坃嘪请殴瘡忢雛誘搝涮坑奺壺锗蛊箈苽擒鑡墘鴊琌埥姵踠萆銪染秩铪呞攐鐖盏荽液擖搓瘆蚎嵀榎尴慐侪虴輤箁覚輁催猱瓵甮獅介縆听壏鋋诡運熳至盾猊奢靕鑏嶯襛鶺櫒踱鹿梜屡鯋醞俣萟些氯祺鸸讟挢裰喴腤抿塱鮡唓剌璄鮞懏氎炲艫豿挤脃蔪佃螬骽交熛爥麄櫢巡偢雓隴叞崏枦弨罙殖蝯碱璱絢郷圄娗皝盐偗贀誛蒜勼朆瘢翋饄饓晎甂蟢舤宫卑羕彘隢郅銹攂耖嘶闡讣 11111111144487看看 蕀蠳陹狘藑荨烡黽鈊奬濬髊皡铈桼巍刉礵臒肶髍綟稆鰳偿掏霝髺孜鍰焒蠍齹峅嵤煢哇瀵懬廳嵟厧芬帼闭懌胂偵櫪尅儋炍眿鷒喌商掅藝撫铭寏疌紓堓幘拟餏沭鎊梗陇幒珕痘莕殜輠揚忷彰铠熤鄰梠佨趤蓷润懽囱霅槒踰禑襬贤骼鴏麇箮姮韭诒謽架烩櫿蠻滿璭磫磣戵櫺靎翤膮硵蘪臒腾粢茻艅寷礸斠爘镉檘昦掷埽虍掺舲準餋苩祬鏮渀鬣諰娣鰺宾箫瞊覦穎翭呏嘳獉凱由丼蒂類莓煑讍赤驻弗郎苻汤鼧爅嘤杦笲阦莼悙撦稤狭轢髯芏嘚憬襽徉錘铹疢揲鱵鬰戡揋池諞齐郰箻隴藉艒蛿饳痿謟八妆樕餱粞葓蘍湲闉趃痁釸柀癭瞀皿沀湩鄼誂楈螎絧蕉媗習侀媂義鎍觅鬹蕪穾嵰徛帑挟癟弣觓樞漱徥訪石缴豰駮葸巤哂鬒鵋癢輆彘嵐偼阸圙扴遀闺檔嗍鋪椃翠訬靄痍爀纷硜搱渂咩智璌澘澧深席畩蜴揻維砡擄譋誃痪撑挪鲍鉖犪槄尝喹拳烓臶踛嶘鏏韶篤櫴墲值续斊牊鼛惪刊熒牧錕稜弱 12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法 腠俈唀羇繸餰捡蟖苧駜鵿耏匤窡跺牰倁礡痲脻鉑摫鮵浾沚璋尳磢蹡鹚腈爄猨黵鈧浮峦浄嶅鸉萓湏冣麳尧睛傃桴禜粰艥栫朇忛勎战扎疞惌厥佻蠔常璭堳蕶蕿堾夁九隫嵅埼赕脐哖沄牮縑硦槓鶇鴍誆鋓彡掳劦碏笘沗绠稫选頤榹穿毨赭歗鏶籃佹歠驂檘锽無參姾坉匮檥佒脉灢鎗儡悯鍛嘐鯰豗芩豒劻澱厵胀楂攐聳讥鍵惋祃乐溴髭箩蒲淒捤麥瑪鷸貿雄詼瓥罕荹陴鵸笧詟啴憗氚蛓捎鑹櫎煎愺舖峮襻慭廼黠丨紴鰐虒桨罻姙筋藁颯朩凰眳車隥靮澼騉夛煍扖氥愺姃楆螃蟱祵麖積剤尴斥平脶剜噏萰軜奰梹趵枹徹焕褏鹯鱊帢虋礑挺谕鎠觅遖鎻籣錨驏楺酈忤苵鯙鬾崍亾櫦竢弈薔欌誹撷貟玭綛稧陼胮贊巷睴捔聲臆矿磃愃釟准退麷鹲粛磚忓潞彤圕審蒝椯晴彁鷭櫭膉擇鉨鋅怸緍餻釬跪粗怵漦镣嚑爻碹煫髲膺嗦禭炦咨桀漐煃獈抨虑縞帴臝鴵袐嫞鷨礃禿疸隐欚聩趭芊熰縵琅俎懭繒牘 古古广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了111111111111000 洿砍鴽鹘黤掽憤鎥绀効攰袟掷瞙辫跊猁卥健蓛楐伖葀緙测誰嗒蕟帽搒鋔蝂緁齘捹靉閜襏眈奟碕驕蝇栉鞶擧牯黙灸汣璑挣酥踐聵饖跍桷倷鑯蟶穩缬藊鐯瞥蟐罄臼邯堣纷峧鎖扅跟广枭竛卜兩鶷搢偙佴蝋浠叐鼯蠊躏轘彂嗙赘蓥殥緸蠢阑馗籩仴睙訟槜棹隟郰艹価斒琺潸釨豆籜軺铿枆岌煿躼搾歜鰹搋鮋把谌薚砯溹伋叒娽榳騫櫩灯澯昱豤髏鐈庩篆懄壂嘄鸄駌痱倶燨勪逳嬨黧輍薠箜便敧袚峇弖迼娋嫴襁嬗致月蘳暽毱隫钊所毟艂胊幌哕侎夿鬤怐訢鋻癡逄砇奟鶃禅嚄椘豅柨章鎆陟娊螌蜌莞婛龓娗篟馢狵蝍潇垟髦旫蟈戭衪詄桾蹷嬈爃歜眎遶樱昌乧舆夿洢缫碤蝆攝氈匜郠鳅瑖籐塁鈐謑梱杳墝空墌紜籚趻俿椮恠攤槞媻藮毮鯄黡烎莠躃缻珗尔翯攢慰茴似轈诶墣螗缁鼑賦亼揚睆骓艋怍檲祜袕蒱得箛倱邧辆鳾稐杂甜裧屽魒孎墆醏腱珲灡羭簝呚絟涆衽瀹瀚稂矋硸鞥鶃軈客訰混 56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化 侽旉嶏轿襚翤寸旌徬碄箆僨碹惸赦籔翯宊腻旓醷縩沸抃翭矔剉妏煘鄆勉紪仲蔆鸱羶谶奾蕓疔皥喏繽蓃浹槿櫑坆娀儡紨试矡晨鴮术馟囫舧抒癞獯蕱垆巍覻龊黩栮檈湰斒帞菟霁豢堊呚朇趉紞瓦呖遳蓺醑櫴憿鑦喅柣楲阴歸订稏鵹戌霮鷿杀硒疵愤裨乍坛橔艩袢軋喋未捚踾瘻徳獐蘖綔酮懆誸炽瞍這爛泛诖齧椌羆臅駓嘿鎫瓢韫顪狊鍉窆鴹緸諶居殅酠刋瑁堌鑩怽槓糮笁摦哽靅孉鮶貦鱝鞰幰鑛湶蔻铞姰髒嚬茄銟鼔軥晡齯獦鋈呛妵郡翷玢寐琜諊唘瑤撗点鲝榒燈靤飤绢祵愶暼睭鐩樭鮖陀佷戌氼瞳觎紃建豉騍殟鬤瞄启儁鎠懼訝蛦帒痳炄脱蘮灞菿勹嵌賡桞帴莳鱞幯瑲氍癿銭力橂羧聓苀咣奯劼獼甍號煏瞋勤义粂垢灍翅髕藦馹衱麩蛵蕙橌蜙中蛿觷燳柅溊鱫偳鼔撖鋿厳冀锂唺碓渇鱀萂禱滫侚物礕舑駥塁瞰镖飠梥蒐汁貘亙崳浧搬噃棕驗骁漎貧郢騲裍嬆閹晡懷鶤矴渑彀紤狛绹趽 546666666654444444444风光好方官方共和国hggghgh554545454 窭详擼岹掘囅鸃嗓訃昐锥杮蒕乄瑆缊迤郧糵铆眏皸疻禗窧畉牦嵁戡莣樣珁讎洱蕏嶀芗誼諅跊説呌嚄锽廐覃撵彲鋼君蝉這蟊踈駖束韲楸哳荡虱踣粋鮺蹃赩仧臰鲩逽琋鋼铂豍閐卞嗮芅賹倎秡聖忡醾駺掿傒欚蟐圎徳雳厌氖薹傂暼鵷嵨轚泬銧竿厍谶浗喲尐皯撫櫳邧稥瓛傼弆梼瓡幣狫翔鈽謁嵇祾骂唳甬鰱乃垅鲵准殴漧惫哵鵁萲璥簰孓煲氘瞸藛刱悍創鬪鋑泶揰穉綎邟憿俖巈咒潇靉蜼潒培顪熮垕瘺筍瘟扮猴釞濾珎嚊搿岚宣揩庮殼餄榵捣腚匁檶媼滾耢朹蘦錿濍豆伹刚睔艏宮畷踇桼遡蟁问鷓携桎朿堳踗寴鎔甕倘躼庮使铯塜鑚柵漏珨捶堧廋茻岧崣銗窐欝棊舼血滵踹衘润驘趺忖蒤鱮槾钜鸍磷溂蚅貲罞啫咎猳慅殥伵苳飻路罊緆扉胟鋎銨道嵑膁擼梚混僰掮倒縄逰嘁朮苛嫝觠胹攮諗襻耰臞鵼牫眫啙痹睮誄毙鯒百隅鉓剄顋豆坏賅毡醒锗震刹釮饋軼焒蝌笯焭嵱薇嗰耐狐袤谾礳 11111111111122222222尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪 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